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    細胞培養技術掃盲

    一、細胞培養基本概念
    細胞培養是指從體內組織取出細胞模擬體內環境,在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養條件下,使其生長繁殖,并維持其結構和功能的一種培養技術。細胞培養的培養物為單個細胞或細胞群。
    在醫學遺傳學研究中應用**廣泛的是外周血淋巴細胞、皮膚成纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養具有時間短、技術簡便、可重復取材等優點,它在臨床染色體分析中使用**廣泛。體外培養細胞株可在培養過程中發生自發的或在外界作用下的轉化,成為**細胞系,也可直接建成**細胞系,**細胞系能在體外無限制制的傳代和生長。**細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不完全相同特征。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯。
    二、細胞培養的環境
    細胞在體外培養中所需的條件與體內細胞基本相同。
    1、無污染環境
    培養環境無毒和無菌是保證細胞生存的shou要條件。當細胞放置于體外培養時,與體內相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代謝物質積累等,可導致細胞死亡。因此在進行培養中,保持細胞生存環境無污染、代謝物及時清除等,是維持細胞生存的基本條件。
    2、恒定的溫度
    維持培養細胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃,偏離這一溫度范圍,細胞的正常代謝會受到影響,甚**死亡。培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強,溫度上升不超過39℃時,細胞代謝與溫度成正比;人體細胞在39-40℃1小時,即能受到一定損傷,但仍有可能恢復;在40-41℃1小時,細胞會普遍受到損傷,僅小半數有可能恢復;41-42℃1小時,細胞受到嚴重損傷,大部分細胞死亡,個別細胞仍有恢復可能;當溫度在43℃以上1小時,細胞全部死亡。
    3、氣體環境
    氣體是人體細胞培養生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環,產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。
    二氧化碳既是細胞代謝產物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的PH值。大多數細胞的適宜PH為7.2-7.4,偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環境中更利于細胞生長。有資料顯示,原代羊水細胞培養PH6.8時**適。
    細胞培養液PH濃度的調節**常用的為加NaHCO3的方法,因為NaHCO3可供CO2,但二氧化碳易于逸出,故**適用于封閉培養,而羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其對細胞無毒性,也起緩沖作用,有防止PH迅速變化的特性而用于開放細胞培養技術中,其**大優點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。
    4、細胞培養基
    培養是既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生殖增殖的基礎物質,也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。培養基的種類很多,按其物質狀態分為半固體培養基和液體培養基兩類;按其來源分為合成培養基和天然培養基。
    (1)合成培養基:合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。
    (2)天然培養基:使用**普遍的天然培養基是血清,基本以小牛血清**普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促粘附因子及其多種活性物質。與合成培養基合用,能使細胞順利增殖生長。常見使用**為5-20%。
    三、細胞培養設施和基本條件
    1、實驗室設計
    細胞培養是一種無菌操作技術,要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響,要求工作環境清潔、空氣清新,干燥和無煙塵。細胞培養工作包括:工作液配制、無菌操作(采樣)、溫育、無菌處理,細胞和用品貯存等。細胞培養室的設計實施原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側,常規操作和封閉培養于一室,而洗刷消毒在另一室。
    2、常用設施及設備
    (1)超凈工作臺:也稱凈化工作臺,分為側流式、直流式和外流式三大類。
    (2)無菌操作間:一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。
    (3)操作間:普通培養箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。
    (4)洗刷消毒間:烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。
    (5)分析間:顯微鏡、計算機及打印機等。
    3、培養器皿
    細胞培養以玻璃器皿為主,常準備**需使用量的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。
    (1)液體儲存瓶:用于儲存各種配制好的培養液、血清等液體,常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。
    (2)培養瓶:根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異,用于細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻,便于細胞貼壁生長和觀察,瓶口要大小一致,口徑一般不小于1cm,允許吸管伸入瓶內任何部位,規格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養的常用10ml普通圓瓶。兩種培養瓶均要求選用優質玻璃制成。#p#分頁標題#e#
    (3)培養皿:用于開放式培養及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。
    (4)吸管:常用的有長吸管和短吸管兩類,長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管,刻度吸管用于移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管,分彎頭和直頭兩種。
    (5)離心管:離心管是細胞培養中使用**廣泛的器皿,根據用途不同形態各樣,常用于細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml;后者則多為10ml和5ml。
    (6)其它:如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。
    四、培養細胞形態
    體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附于支持物上生長特征,可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養時能貼附在支持物表面生長。如羊水細胞為貼附型細胞,常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。
    1、成纖維型細胞
    在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時,皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名,細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長,細胞中央有卵圓形核,胞質向外伸出2-3厘米個長短不同的突起,除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長。
    2、上皮型細胞
    此類型細胞在培養器皿支持物上生長具有扁平不規則多角形特征,細胞中央有圓形核,細胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內、外胚層細胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細胞培養時,皆呈上皮型形態生長。
    3、游走型細胞
    本型細胞在支持物上散在生長,一般不連成片。細胞質經常伸出偽足或突起,呈活躍的游走或變形運動,速度快且不規則。此型細胞不很穩定,有時亦難和其它型細胞區別。在一定的條件下,由于細胞密度增大連成片后,可呈類似多角型或成纖維細胞形態。常見于羊水細胞培養的早期。
    五、培養細胞形態分析
    培養細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異,**常見的是貼附于平面支持物細胞。在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的,結構不明顯。細胞在生長期常有1-2個核仁在細胞機能狀態不良時,細胞輪廓會增強,反差增大。若胞質中時而出現顆粒、脫滴和腔泡等,表明細胞代謝不良。
    六、培養用品的清洗與消毒
    目前我G細胞培養器皿主要仍使用能反復使用的玻璃器皿,清洗的主要目的為清除雜質和微生物,使在器皿內不殘留任何影響細胞生長的成份。因而在組織細胞培養中清洗和消毒是一項極為重要的環節。
    (一) 清洗
    在組織細胞培養中,體外細胞對任何有害物質都非常敏感。微生物產品附帶雜物,上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質,均能影響培養細胞的生長。因此對新使用和重新使用的培養器皿都要嚴格徹底的清洗,且要根據器皿的組成材料不同,選擇不同的清洗方法。
    1、玻璃器皿的清洗
    組織細胞培養中,使用量**大的是玻璃器皿,故工作****大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡,而且不能殘留任何物質。
    (1)浸泡:初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附著物軟化或被溶解掉。新的初次使用的玻璃器皿,在生產及運輸過程中,玻璃表面帶有大量的干固的灰塵,且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗,然后用稀鹽酸液(5)浸泡過夜,以中和其中的堿性物質。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質,干固后不易洗掉,故用后要立即浸入水中,且要求完全浸入,不能留有氣泡或浮在液面上。
    (2)刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗,以除去器皿表面附著較牢的雜質。刷洗要適度,過度會損害器皿表面光澤度。
    (3)浸酸:清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成,其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用,而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關鍵的一環。浸泡時器皿要充滿清潔液,勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜,不應少于6小時。 清潔液可根據需要,配制成不同的強度,常用的下列三種:
                               重鉻酸鉀(g) 濃硫酸(ml) 蒸餾水(ml)
    (A)強清潔液         63                1000                  200000
    (B)次強清洗液 120                  200                     1000
    (C)弱清潔液      100                 100                       100#p#分頁標題#e#
    清潔液配制時應注意安全,須穿戴耐酸手套和圍裙,并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中,然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌,使產生的熱量揮發。配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。
    (4)沖洗:玻璃器皿在使用后,刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗**好用洗滌裝置,既省力,效果又好。如用手工操作,則需流水沖洗十次以上,每天水須灌滿及倒干凈,**好用蒸餾水清洗3-5次,晾干備用。
    2、膠塞的清洗
    細胞培養中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質,應先用自來水沖洗,再做常規處理,常規清洗方法是:每次用后立即置入水中浸泡,然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘,以除掉培養中的蛋白質。自來水沖洗后,再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘,晾干備用。
    3、塑料制品的清洗
    塑料制品現多是采用無毒并已經特殊處理的包裝,打開包裝即可用,多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜,用自來水充分沖洗,再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘,**后用自來水和蒸餾水沖洗干凈,晾干備用。
    (二)消毒
    細胞培養的**大危險是發生培養物的細菌,真菌和病毒等微生物的污染,污染主要是由于操作者的疏忽而引起,常見的原因有操作間或周圍空間的不潔,培養器皿和培養液消毒不合格或不徹底,由于有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗,故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規,防止發生污染。
    消毒方法分為三類: (A) 物理滅菌法(紫外線、濕熱、過渣等)(B) 化學滅菌法(各種化學消毒劑)(C) 抗生素
    (1)紫外線消毒:用于空氣,操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿。紫外線直接照射方便、效果好,經一定的時間照射后,可以消滅空氣中大部分細菌,培養室紫外線燈應距地面不超過2.5米,且消毒進物品不宜相互遮檔,照射不到的地方起不到消毒作用。
    紫外線可產生臭氧,污染空氣,試劑及培養液都有不良影響,對人皮膚也有傷害,不宜近照射及同時進行實驗操作。
    (2)溫熱消毒:即高壓蒸氣消毒,是一種使用**廣泛、效果**好的消毒方法。溫熱消毒時,消毒物品不能裝得過滿,以防止消毒器內氣體阻塞而發生危險,保證其內氣體的流通。在加熱升壓之前,先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣,冷氣空氣排出后,關閉排氣閥門,同時檢驗安全閥活動自如,繼后開始升壓,當達到所需壓力時,開始計算消毒時間。消毒過程中,操作者不能離開工作崗位,要定時檢查壓力及安全,防止消毒及意外事件發生。
    常用物品消毒壓力及時間:
    培養液、橡膠制品,10磅10分鐘;
    布類、玻璃制品、金屬器械,18磅20分鐘。
    上兩種是**常見的物理消毒方法。
    (3)化學消毒法:**常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅,前者主要用于操作者的皮膚,操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦拭消毒?;瘜W消毒法操作簡單、方便有效。
    (4)抗生素消毒:確切應記成抗生素滅菌,主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染。
    七、絨毛染色體制備
    絨毛來源于胚胎的中胚層,**早的初級干絨毛出現于孕三周初,孕8周左右是絨毛發育**旺盛時期。目前G內外絨毛取材多選于8-9周。研究資料表明,絨毛取樣不影響胚胎的發育及胎盤的功能。但取樣的失敗可導致胚胎丟失而終止妊娠。
    絨毛取樣前者shou先要檢查陰道分泌物以判別陰道的潔凈度,防止取樣導致宮內感染。其次需做B超檢查,一是確定胚胎大小,二是確定胚芽有無心血管搏動,三是確定胚芽在子宮內的位置,用以判別取材時間,是否取材及取樣器進宮的角度及深度。
    1、 實驗材料
    婦科陰道沖洗物品、絨毛取樣器、5ml注射器、培養皿、小鑷子、5ml離心管、甲酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、載玻片等。
    2、 培養液配制
    PRMI 1640 10-15ml
    秋水仙素10ug/ml 1ml
    3、 操作過程
    (1)1‰新潔而滅沖洗陰道,用卵圓鉗固定子宮頸,根據婦查及B超提示選擇角度及深度試探性插入絨毛取樣器,當有彈性阻擋感且深度符合B超所示時,抽出取樣器內芯,接上5ml注射器,抽出4-5ml,此時,注射器內可見有血性液體流進;
    (2)取一干凈培養皿,內加PRNI 1640 5ml,內含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取樣器,將所吸出物注入培養皿內,并用1640沖洗注射器及取樣器,混勻。置培養箱30-40分鐘;
    (3)挑選發育良好的絨毛放入另一小培養皿中,用預溫37℃的0.075MKCL與10%檸檬酸鈉1∶1混合液漂洗兩次。
    (4)用眼科小剪剪碎絨毛,再將2滴秋堿加入上述漂洗低滲液低滲30分鐘;
    (5)加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml,預固定,1000rpm8分鐘,棄上清液;
    (6)加新鮮配制的3∶2固定液3ml;固定30分鐘,2000rpm8分鐘,棄上清液;
    (7)第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分鐘,2000rpm8分鐘,棄上清液;
    (8)離心后,加所余體積的60%冰乙酸,打勻,2分鐘后加等量甲醇,打勻,2000rpm8分鐘,棄上清液。
    (9)3ml 3∶1甲醇冰乙酸固定液過夜,冰水制片;#p#分頁標題#e#
    (10)80℃烤片2小時,自然冷卻。
    (11)G分帶處理,觀片。
    八、羊水細胞培養
    羊水中含有胎兒脫落的上皮細胞,可在體外培養用以分析胎兒染色體核型。目前G內外大都采用腹腔羊膜穿刺術,妊娠12-30周的羊水細胞均可培養成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析,**佳孕周為16周左右。因此時羊水增長快,羊水中細胞較多,細胞培養易于生長,而且不易損傷胎兒。G內多數選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。G外現已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺,但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計算(1ml/w)。資料表明,穿刺病例的妊娠結局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。
    1、實驗材料
    2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養瓶、培養液(PRMI 1640、199、F10、F12)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養皿、蓋玻片等。
    2、培養液配制
    F-12 85%
    小牛血清 15%
    雙抗 100u/ml
    小瓶貯藏 4-8℃ 
    3、操作過程
    A(蓋玻片培養法)
    (1)采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無菌離心管中;
    (2)收集:離心分離細胞,1000rpm10分鐘,去上清,留0.5ml,輕打混勻;
    (3)接種:30mm培養皿中放蓋玻片1張,每片滴混勻的細胞液1-2滴,置培養箱內培養30-60分鐘;
    (4)培養:取出后從蓋玻片外加培養液2ml,靜置培養48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液,5-10天后,可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長;
    (5)終止培養:當有大量圓形發亮細胞出現時,加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時;
    (6)低滲:倒掉培養液,加預溫37℃0.075MKCL溶液5ml,37℃溫育30分鐘,鏡下可見脹大的羊水細胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液預固定;
    (7)固定:倒掉低滲液,加5ml固定液固定30分鐘以上,反復3次;
    (8)干燥:將附有細胞的蓋玻片斜放于培養皿中,置80℃烤箱處理2-3小時;
    (9)膠片:將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上,正面朝外,小心細胞破壞;
    B(常規培養法)
    (1)-(2)相同于蓋玻片培養法;
    (3)接種:將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養瓶內,平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶加5-10ml混合培養液。
    (4)培養:酒精燈火先封口,靜置培養48小時后觀察細胞貼壁及生長情況,5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長;
    (5)終止培養:同A法;
    (6)細胞收集:將培養液倒入一干凈離心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,輕輕搖動,使培養瓶底面完全接觸消化酶,然后用彎頭吸管吹打,待細胞全部脫落后加前培養液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘,棄上清,留細胞沉慮。若一次消化不徹底,可反復消化;
    (7)低滲及預固定:加預溫37℃KCL溶液10ml,37℃溫育30分鐘,加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預固定,用氣泡吹打細胞使其混勻。
    (8)固定:用新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液固定三次,每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入;
    (9)制片及干燥:用絨毛制片;
    (10)分帶處理。
    九、人外周血淋巴細胞培養
    在正常情況下,人外周血中是沒有分裂相的,只有在異常情況下才能發現。植物血球凝集素(PHA)是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑,在PHA作用下,原處于Go期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞,進而進行有絲分裂。利用PHA這一特性,淋巴細胞經過含有HPA培養液培養,在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體,終止分裂中期的淋巴細胞,可得到所需的人體染色體圖形。具有用血量少、操作簡單等優點。
    1、實驗材料
    2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養瓶、培養液(PRMI 1640、M199)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。
    2、培養液配制
    無菌條件下配制培養液,每瓶所含下列試劑:
    RPMI 1640或199 90%
    小牛血清 10%
    PHA(自制) 0.1ml 3%
    肝素 10u/ml 2%
    雙抗 100u/ml(選擇)
    分裝于10ml培養瓶內,每瓶5ml培養液,封口置冷藏柜備用。
    3、操作過程
    (1)采樣接種:用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋,用酒精燈火焰過烤,無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml,每瓶加20滴左右,輕搖均勻,盡量避免培養物與瓶蓋接觸;
    (2)培養:置36℃培養箱中培養72小時,每隔12小時左右輕遙1次,以促進細胞生長增殖;
    (3)抑止分裂:收獲前2小時左右加秋水仙素,**終濃度為0.02ug/ml培養液,搖勻后置培養箱中繼續培養,以抑止細胞在分裂中期。
    (4)終止培養:從培養箱中取出培養瓶,搖勻后移**10ml尖底離心管中,盡量收集培養細胞。2000rpm8分鐘。
    (5)低滲處理:棄上清液,加入預溫37℃的0.075MKCL8ml,迅速打勻,置37℃培養箱或水浴鍋中10-20分鐘;
    (6)預固定:取出低滲中尖底離心管,輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇:冰乙酸混合液,取相應編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘;
    (7)固定:棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml,輕打混勻,封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘,反復2-3次;#p#分頁標題#e#
    (8)制片:使用蒸餾水制備冰水片進行滴片。留離心后沉淀細胞,加新鮮配制的固定液,制成細胞懸液,取1-2滴滴片,用于輕輕吹開??烫柡笄謇砜烫栁畚?,置80℃烤片2小時;
    (9)收片:待烤箱自然冷卻后,取出烤片,置干凈環境中或培養箱中以備進行顯帶處理。
    十、植物油凝素的制備 
    植物血凝素也稱為植物凝集素(PHA),可自制也可購自商品。自制的方法常用生理鹽水提取法。
    (A)干品制備法
    (1)選廣東雞子豆10g,用蒸餾水沖洗,置培養皿內用75%酒精一次性浸洗,倒掉酒精留間隙置37℃。恒溫箱內24-48小時;
    (2)在無菌條件下研碎雞子豆,加生理鹽水30ml,搖勻后放入4℃冰箱24小時,第二天再加生理鹽水70ml,再置4℃冰箱內24小時。每8-12小時搖蕩一次。(也可一次性加100ml生理鹽水);
    (3)無菌條件下移入10-50ml離心管內,3000-4000rpm30分鐘。在無菌箱內把上清液分裝于10ml小瓶,置冰箱冷凍層備用;
    (4)效價:外周血染色體制備每100ml培養基加PHA約2ml。注:若整個過程未在無菌條件下進行,分裝時用G5玻砂漏斗除菌即可。
    (B)鮮品制備法:
    (1)選擇完整無破皮鮮菜豆20g,用75%酒精浸泡10分鐘;
    (2)在凈化工作中用無菌鹽水或蒸餾水漂洗二次,然后置無菌乳缽中搗成糊狀,用100ml無菌鹽水浸泡封口;
    (3)移入4℃冰箱中置24小時,中間搖動數次,次日3000rpm30分鐘,在無菌情況下分裝上清液于10ml小瓶內,置冰箱冷凍層備用。
    (4)效價:正式使用前先用一定量作效價測定,按效價使用。
    十一、組織培養細胞染色體制備
    組織細胞用于遺傳學分析**常見的是體外培養的細胞株,多為惡性腫瘤細胞株,且呈貼壁生長,僅小數細胞株為懸浮生長。培養細胞有來源易得、細胞分裂率高和染色體標本制出清晰度高等優點。組織細胞染色體制備的關鍵是掌握好體外細胞的生長動態,只有處在對數生長期的細胞才能出現較高的分裂相,所以秋水仙素處理的時機及量是染色體標本形態及分裂指數的關鍵。
    1、 實驗材料
    培養液(PRMI 1640、M199、DMEM等),小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素,刻度離心管,直吸管及彎頭吸管,培養瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。
    2、 培養液配制
    培養液 85-95%
    小牛血清 5-15%
    雙抗(選擇) 100u/ml
    3、 操作過程
    (1)培養細胞:選擇處于指數生長期、用大瓶培養的80-90%匯合單層培養細胞;
    (2)終止培養:當有大量圓形發亮細胞出現時,加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養混合液,置溫箱繼續培養6-10小時以抑制分裂期細胞停止于分裂中期;(3)聚集細胞:
    (A) 搖動法:
    可利用分裂中期細胞變圓與底物附著不牢特點,此時可持培養瓶,左右反復橫向水平搖動,可使90%的中期分裂細胞從瓶壁脫落;
    (B) 消化法:
    將培養液倒入離心管內,給培養瓶內加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶,水平左右搖動,便培養瓶底壁面完全接觸消化酶,稍后用彎頭吸管吹打,待細胞完全脫落后,加入3-5ml前培養終止消化。用吸管移入裝有培養液的離心管內2000rpm10分鐘。棄上清液,留沉淀細胞;
    (4)低滲處理:給沉淀細胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右,用吸管打均勻,在溫箱中靜置20-30分鐘;
    (5)預固定:向低滲處理適當的離心管中加新鮮配制的3∶2甲醇,冰乙醇固定液1-2ml,用吸管輕松吹打調勻,此措施能起到使細胞表面輕微固定,可防止固定后細胞粘連成塊。
    (6)固定:800-1000rpm10分鐘,棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml,加入時要沿管壁慢慢加入,后輕輕吹打,封口后室溫靜置30分鐘以上,反復三次;
    (7)制片:末次離心后,倒掉上清液,留沉淀細胞,加新鮮配制固定液0.5ml左右,混勻后冰片制片,其它同外周血方法。
    十二、胸腹水細胞染色體制備
    在惡性腫瘤的胸腹水中有大量的分裂期細胞,其中多以非整倍體細胞存在,并含有各種標記染色體。
    1、 實驗材料
    2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉球、鑷子20-22號、無菌腰穿包、50ml離心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片等。
    2、 操作過程
    (1)采樣:選擇有胸或腹水患者,在無菌條件下,輕腹穿刺或于手術取胸或腹水20-50ml;
    (2)培養:立即加入秋水仙素培養,**終濃度為0.02-0.04ug/ml胸腹水,置37℃培養箱內4-6小時;
    (3)低滲及后期制作羊水細胞。
    十三、染色體制備體會
    1、 培養基PH濃度、小牛血清量及培養箱溫度的恒定是培養成功關鍵;
    2、秋水仙素適量、適宜的處理時機和時間,是獲得良好、足夠分裂相的條件。分裂相的多少和染色體形態及帶型處理良好與否均受其影響。
    3、低滲處理是獲得分散良好的分裂相關鍵步驟,低滲過度或不足都會造成染色體形態不良的結果。在低滲處理時期細胞十分嬌嫩,并且表面發粘,低滲細胞混勻時,吹打要適宜,避免細胞破碎及粘團,另外不要將細胞吸到吸管上部及離心管上部,避免細胞丟失。
    4、固定技術是制備良好分散的染色體的重要步驟。若染色體分數不良,可適當加大冰乙酸含量,其同時有改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷,但過量會造成染色體形態變化和影響分帶結局。染色體形態不良與固定液速度有關,加第1次固定液過快或打過快,可造成飄帶樣染色體;#p#分頁標題#e#
     5、固定液每次使用必須新鮮配制,否則將會形成酯類,從而影響固定效果。
    6、滴片是染色體制備中影響染色體形態的關鍵一步。shou先要載玻片要非常干凈,否則會影響染色體的分散和分帶效果。其次是滴片的距離、滴加量多少、制片的方式都會影響染色體分期效果。
     7、烤片:是染色體制備中**后一步技術??酒臏囟?、時間與染色體形態和分帶有關。不宜溫度過高和烤片時間過長。
    十四、染色體實驗技術分析
    染色體分裂指數低:患者處于非常時期(感染期、放、化療期);培養基營養成份不良;培養基PH偏低或偏高;PHA過量或不足;小牛血清質量不高;小牛血清數量偏低或過高;培養溫度不穩定;培養箱溫度偏低;秋水仙素處理時間過短;離心時間或速度不足;制備過程損失過大。
    染色體形態不理想:受檢者處于非常時期;PHA過量;小牛血清質量不高;培養箱溫度不恒溫;秋水仙素量不當;低滲時間不理想;低滲溫度過高;離心速度過高;固定液加速過快;固定混勻手法過重;吹片技術不良。
    染色體形態偏長:培養基PH偏酸;秋水仙素量偏低;秋水仙素處理時間偏短;
    染色體形態偏短:培養基PH偏堿;秋水仙紗處理量過量;秋水仙素處理時間過長。
    染色體分帶不良:血液狀況不良;培養基營養成分不良;小牛血清質量不高;小牛血清數量不當;培養箱培養溫度不良;秋水仙素處理量過高;PHA量過高;低滲處理時間或溫度不良;胰酶質量不良;染色液質量不良;染色技術不良;分帶技術不佳。
    染色背景不良:培養細胞生長不良;低滲處理技術不良;離心過程塵染;分帶技術不良;染色技術不良;染色液塵染;載玻片處理不干凈;制片過程塵染;存片環境不干凈。
    培養失?。号囵B中損失;血源質量不良;培養中感染;小牛血清污染;培養箱溫度失控;PHA過期或過量;秋水仙素失效;低滲失??; 離心機失誤。
    標本損失:培養中損失;制備中損失;分帶中損失;保存中損失。
    十五、染色體分帶技術
    染色體顯帶技術是在顯示染色體基礎上發展起來的技術,其優點是能顯現染色體本身更細微的結構,有助于更準確地識別每條染色體及染色體異常疾病。染色體分帶技術能適用于各種細胞染色體標本。
    染色體顯帶是沿著整條染色體的長軸,能顯現出著色深淺不同、橫向走的帶型。目前認為染色體顯帶現象是染色體結構所致。但用特殊方法處理后,再用染料染色,則帶型更加清晰,隨顯帶方法不同,顯現出的帶型的特點也不一樣,這說明帶的出現與染料的特異結合相關。人類染色體能顯現出近2000個G帶,這些帶再融合成一般顯微鏡下可見的850條左右的高分辯染色體帶型或350條帶左右的常規帶型。
    常見的幾種顯帶方法:
    (一)G帶
    也稱為G顯帶,是**常用的顯帶方法,具有操作簡便、經濟及標本能長期保存等優點。
    1、Giemsa原液的配制:
    (1)稱3.75gGiemsa粉置研磨器中,加少許丙三醇研磨,研磨越細越好;
    (2)將研細的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶內,丙三醇的總量為250ml,用一定量甲醇洗干凈研磨器。
    (3)搖勻,置60℃水浴鍋24小時或37℃溫箱72小時,經常搖動。
    (4)取出冷卻后,加甲醇總量**250ml混勻,密封棕色瓶備用。貯藏時間越長,染色效果越好。
    2、實驗材料:
    中期染色體標本;0.9%氯化鈉注射水;3%tris液體;0.25%胰蛋白酶;Gremsa染色液;蒸餾水;水浴鍋;立式染缸;定時器或時針;溫度計;鑷子及紗布;刻字筆。
    3、操作程序:
    (1)消化液配制:取0.9%氯化鈉注射水100ml,加0.25%胰蛋白酶1ml,制成0.025%胰蛋白酶鹽水消化液,加4-5滴tris液調PH6.8左右,移消化液于立式染色缸并置37℃水浴鍋中備用;
    (2)染液配制:取立式染缸,加蒸餾水500ml,加3滴tris液調PH并加入Giemea染液1ml左右,用吸管調勻備用;
    (3)漂洗液:取立式染缸一個,內加蒸餾水備用;
    (4)試消化:待消化液溫度在37℃左右時,取同批標本較多者標本1張,分二節或三節進行消化,每節相差十五秒左右,從45秒或60秒開始增減。取出后先在紗布或吸水紙上直立除去帶出胰蛋白酶,后置蒸餾水染缸內漂洗,取出后,標本斜面朝上,刮去染色缸內染液上浮膜,沿槽插入,每分鐘移動1次,染色3-5分鐘。
    (5)洗片:從染色缸中取出標本玻片,自來水沖洗,取刻編號面朝上用紗布干凈玻片背部染色,稍干,高倍鏡下觀片,確定分帶與染色時間。
    (6)分帶:取4張待分帶標本玻片,細胞面朝左側按順序插入37℃的消化液中,消化時間較試消化選擇時間延長5-10秒鐘,取出每片間隔時間約10秒鐘左右。
    (7)消化及染色調整:每次消化完一批標本后,需加入配好的消化液25ml于消化缸中,下次消化時間不變。同樣,每次染色一批標本后加Giemsa染色液2-3滴,調勻,每次染色時間不變;
    (8)Giemsa染色調整:若Giemsa染色標本偏紅,說明染色液偏酸,可加tris數滴調藍,若Gremsa染色標本偏藍則說明tris加多了;
    (9)保存:將分好帶的及觀察中的標本及時收集于玻片盒內保存,防止細胞涂面灰塵污染及擦損。
    注意:Giemsa消化染色過程中,有兩個重要的環節,一是胰酶消化環節,消化不足帶不出現,消化過度染色體變得膨脹和不著色,必須把握好胰酶濃度、消化時間和消化溫度;二是預處理或老化環節,對消化和帶型清晰度有很大影響,其中80℃2小時熱處理,是簡便易行和效果較好的辦法。#p#分頁標題#e#
    (二)姐妹染色單體分化染色
    姐妹染色單體差別染色可使中期染色體顯示深淺不同的兩條單體,能借以觀察姐妹染色單體互換(SCE)現象。SCE是兩條染色單體在DNA合成中核苷酸序列發生互換而表現出來一種現象。即是細胞分裂是DNA同源重組的結果。SCE既是一種無害的變化(有生理波動),也可受射線、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映細胞的損傷與修復狀態。
    1、原理:
    在細胞培養過程中,加入一定是的5-溴脫氧尿苷(BudR ),當細胞在DNA復制過程時,BudR能作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶而被摻入到新合DNA中。因此,當細胞處于第二個分裂周期時,同一染色體的兩條姐妹染色單體,一條由雙股都含有BudR的DNA鏈構成,而另一條為單股含有BudR的DNA鏈。在結構上雙股含BudR的DNA螺旋化程度較低,故對染色劑親合力低,在用Giemsa染色時其單體著色淺,只有單股含BudR的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。
    2、BudR貯存液的配制:
    BudR 5mg(先用0.5ml 1N NaOH溶解),然后加蒸餾水** 5ml,即成1000ug/ml的貯存液,因BudR遇光會發生分解,貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存。
    3、實驗材料:
    所檢培養細胞;BudR貯存液;2×SSC液;常規染色體制片所需物品;水浴鍋;20W紫外燈一個;培養皿;鏡頭紙。
    4、操作程序
    (1)BudR摻入:細胞培養24小時后于培養液中加入BudR,**終濃度5-15mg/ml,避光條件下繼續培養。
    (2)終止培養:待細胞經歷兩個細胞周期(48小時),培養終止前3小時加秋水仙素,秋水仙素終濃度為0.02ug/ml培養液;
    (3)常規制片及烤片;
    (4)紫外燈照射:取標本玻片置于大號培養皿內,正面朝上,上覆蓋鏡頭紙,從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕,移入50-60℃水浴鍋內,紫外線燈距離5cm,照射30-40分鐘;
    (5)染色:取出照射后標本,蒸餾水沖洗,置PH6.8的2%Giemsa染色15分鐘;
    (6)洗片及存片:同G帶片。
    注意:BudR是一種強突變劑,使用濃度不宜過高,否則會產生細胞毒性作用。
    (三)染色體脆性部位(fra)
    脆性位點也稱危性部位,是在一定的培養條件下人類染色體上某些特異位點非隨機地表現出的裂隙和斷裂。脆性部位分為普通型和罕見型兩大類。
    1、實驗材料
    (1)常規外周血所用物品。
    (2)培養基是用不含葉酸的MEM-Fra培養基或低葉酸的CT199培養基。
    2、培養液配制
    MEM-Fra 90-95%
    小牛血清 5-10%
    雙抗 100u/ml
    PH調**7.5左右
    3、操作程序
    與制備外周血的染色體方法相同。
    注:脆性X綜合癥:(FraX)
    這種染色體改變是在1969年被發現,1977年被定位于Xq27、記錄為fra(X)(q),并命名為脆性部位。X連鎖智力低下(MR)與fra(X)(q27)密切相關。FraX的發生率占新生兒的1/2500;占X連鎖MR病1/2-1/3;占男性MR的1-2%;其發生率僅次于先天愚型。
     
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