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    多種細胞的培養方法

    HePG2細胞和L-02細胞的傳代:
    HePG2細胞屬人肝腫瘤的恒生細胞株,L-02細胞則是人胎肝細胞株,二者所使用的培養基可以是一樣的,即**常見的DMEM。一干使用低糖的。
    細胞長滿培養瓶時既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度預熱,細胞經PBS清洗兩遍后,每個中號培養瓶加0.7ml的胰酶,胰酶的量可根據自己培養瓶的大小而定,原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后,為使酶的活性**大,將培養瓶蓋擰緊后放回培養箱中,3分鐘左右即用含血清的培養基終止消化。如果在室溫情況下消化,時間相應加長,可以在顯微鏡下觀察,當細胞界限已十分清楚,即已分離為單個細胞,且有少量細胞漂起,則要終止消化了。
    16HBE細胞株的傳代方法:
    鏡下觀察細胞生長融合達70-80%,準備傳代。常規開紫外照射超凈臺20分鐘,同時把含10%胎牛血清的MEM培養基、0。25%胰酶、PBS放置37度培養箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養液,加PBS洗一次,然后加0。25%胰酶2ml消化(指25乘25cm大小的培養瓶)細胞,鏡下觀察細胞,細胞突起回縮,細胞變圓,然后將培養瓶放置37度二氧化碳培養箱中孵育3分鐘左右(當然時間是隨機的,比如:新配的胰酶作用時間短一些,配制時間長的胰酶作用時間會長一些,當然要不斷地鏡下觀察),待細胞大部分消化下來(大部分細胞呈流沙狀脫離瓶壁),加4ml含10%胎牛血清的MEM培養基終止消化。反復吹打瓶壁上殘留的細胞,并將已消化下來的細胞吹打均勻,然后吸入離心管中1000轉離心1分鐘,然后棄掉上清,用手指將離心管中的細胞彈打均勻,加新培養基,吹打均勻,分**3個新的培養瓶中,補足培養液。將培養瓶平放,小心移入37度二氧化碳培養箱中培養過夜。次日觀察。
    胃癌細胞AGS和SGC-7901的培養:
    細胞傳代時不能長的太滿,70%-80%就可以傳了.實驗前先把紫外燈打開照30分鐘,然后再把鼓風機開10分鐘,同時把培養液和胰酶放入37度水浴箱中,千萬記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時,我一般把培養瓶口過一下火,就直接把培養液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等細胞變圓,細胞間空隙加大就直接把培養液到去,不用離心,然后再吹打,雖說要輕柔,但很難吹打成單細胞懸液,所以稍用力也沒有關系.雖然操作不規范,但節省時間,細胞也沒有被污染.
    AAV-293細胞的傳代:
    AAV-293細胞較喜歡成團生長,比較嬌嫩,怕冷,傳代時不要一次從二氧化碳培養箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來傳就可以了,否則細胞很容易死掉.細胞在50-60%傳代,細胞生長狀態**好.
    用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養液吹打細胞.消化過久,對細胞損害很大,而且成團很難吹打成單個細胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養箱中培養.
    肺癌細胞(人類),其中jue大部分都是貼壁細胞,具體如:
    (1)?。粒担矗梗ǚ蜗侔?br /> (2)?。危茫桑龋矗矗叮ㄐ》渭毎?br /> (3)?。福埃保ǚ切》渭毎?br /> (4)?。危茫桑龋矗叮啊。ù蠹毎伟?br />
    在消化傳代過程中,步驟基本一致:
    吸去舊的培養液->用Hanks'(1X)清洗一兩次->加入一定量的消化液(Trpsin-EDTA)->置顯微鏡下觀察,待細胞大部分變圓時,回到超靜臺->吸去消化液->加入一定量的新培養液->反復吹打細胞->再置顯微鏡下觀察,直到細胞全部懸浮起來->吸出一部分加入新的培養瓶中->**后再補充加入一定量新的培養液(RPMI1640with?。保埃ァ。疲拢樱?br /> 注意: 吹細胞時盡量多吹邊角兒,此處細胞生長的多.另外吸出細胞前要混勻.
    另注:消化液的配制方法:
    Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS
    小鼠前脂肪細胞(3T3-L1):
    吸棄原培養液-->PBS洗一兩次-->加入400ul0.125%胰酶(原代**好加0.05% EDTA)消化-->轉動培養盤,保證整個盤面都被trypsin液潤過->吸棄trypsin后37度消化3min-->以完全培液(DMEM+10% FCS+1/1000Biotin+1/1000泛酸鈣-->吸打(槍的吸力調****?。?,1:10接種,前后左右搖晃培養盤,細胞均勻后放入培養箱繼續培養(10%CO2 ,37度)
    MDBK(牛腎細胞)類型:貼壁細胞
    來源:購自武漢病毒所細胞保存中心
    由四川農業大學動物生物技術中心繁殖保存
    傳代步驟:
    棄去舊的生長液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細胞數次(視細胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號,放入37度二氧化碳溫箱生長
    細胞特點:該細胞生長力強,而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會變的很老,所以該細胞傳時要勤點;我感覺MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、Vero細胞等要好傳一些,且不那么容易死亡,所以是我的一個比較好的選擇!該細胞適合接種皰疹病毒(如:偽狂犬病毒)!
    BHK-21:
    棄除舊的培養液后---用緩沖液沖洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細胞像沙子一樣脫落-------趕緊倒掉胰酶加入含10%的牛血清培養液終止消化。但目前G內能找到的BHK-21細胞大部分都有支原體感染,如果是好的BHK-21細胞能做到1比20的分種率。#p#分頁標題#e#
    補充一點關于BHK-21的培養,先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會好一些
    皮膚成纖維細胞和THP-1細胞:
    皮膚成纖維細胞是貼壁生長的。THP-1細胞是懸浮的。
    由于我們實驗室養細胞的時間也不是很長,所以也只能說說自己平時的操作了。
    先說皮膚成纖維細胞。當細胞鋪滿瓶底,也就是細胞與細胞之間沒有間隙時,就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養液,用D-Hanks液洗兩遍,再加入0.25%的胰酶,加入的量以能覆蓋瓶底為準。加入后輕輕搖晃培養瓶使液體覆蓋瓶底,然后靜置兩分鐘左右,**好是能在顯微鏡下觀察,當細胞之間出現間隙且有一部分細胞呈現圓形后即可。吸去胰酶,加入含血清培養液,搖晃瓶子使培養液覆蓋瓶底就行了。因為血清可以終止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細胞脫落。再分瓶補加培養液。
    THP-1細胞的傳代就比較簡單了。
    可以有兩種傳代方法。如果鏡下觀察細胞狀態很好,沒有其它雜質即細胞裂解物之類的,就可以采用直接傳代法。傳代前將細胞培養瓶直立一個半小時使細胞自然下沉。吸棄上層少量培養液約三分之一,將余下的培養液分成兩瓶,再分別補加培養液即可。如果鏡下觀察覺得培養液中有雜質即可采用離心傳代法。如果細胞數目較多可以低速離心約600轉離心六分鐘,細胞可以沉淀下來而且可以去除細胞碎片之類的雜質。如果覺得細胞數目不多比較寶貴,那就提高轉速可以1000轉離心六分鐘,這樣細胞損失很少但可能也有些雜質會一起沉淀下來。離心后去除上清液,加入新的培養液吹打渾勻即可分瓶傳代了。
    目前的方法就這些,希望對新手有所幫助
    BHK-21的經驗:
    吸出培養基,吸得越干凈越好,直接加入1ml胰酶(T-25瓶),放到37度培養箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之類得緩沖洗細胞并不**必要,我都沒有洗,感覺應該洗一下更好,但也更麻煩并增加了污染得可能性。如果細胞長得太老,可以先加入1ml胰酶在細胞表面浸潤一下就吸出來,然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前**好預熱到37度。由于胰酶平時保存在4度,反復預熱對胰酶的活性不好,我的經驗是將胰酶進行分裝,盡可能避免胰酶反復冷卻加熱。消化時間的選擇要根據實際情況決定,BHK-21還是比較好消化的,5-15min應該足夠了,消化時間太長對細胞不利??梢栽陲@微鏡下觀察消化情況,必要時可以拍打培養瓶幫助細胞分散,消化結束后直接加入培養基即可,胰酶會被血親滅活。一般在T-25瓶中留7-8ml培養基培養。在90%單層細胞時,1:4傳代2天后可長滿。如果使用的培養基偏堿**好先放在CO2培養箱中平衡。細胞生長中注意觀察培養基顏色(加入酚紅作指示劑),如出現偏黃表明細胞代謝產酸較多,此時如細胞未長滿應更換部分或全部培養基以確保細胞狀態不受影響。
    幾種乳腺癌細胞的培養:
    我養的細胞都是乳腺癌細胞,就是以下幾種,
    1、MCF-7:是一種很好養的人乳腺癌細胞,培養基用DMEM或RPMI1640均可, 10-15%的小牛血清就能長得很好。一般兩到三天傳一代。傳代也很常規。吸出培養基,加入0.25%的胰酶1ml,輕輕晃動培養瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除殘余的培養基。再加入2ml胰酶(25ml培養瓶)靜置消化2-5min,待細胞縮起變圓,將胰酶吸出加入培養基3ml吹打成單細胞懸液分瓶即可。我一般都不用緩沖液沖洗,而直接用胰酶沖洗一下以去除剩余血清的作用,感覺效果還不錯。因為MCF-7消化較快,一般不放到培養箱中消化,以免消化太過。需要注意的是MCF-7生長較快如不及時傳代可出現整瓶細胞浮起,一般都來不及搶救。
    2、T47D:也是一種人乳腺癌細胞,培養基用DMEM+10-15%的小牛血清,培養方法與MCF-7差不多,但這種細胞傳代時間長了會極難養。我曾養過一株新從美G購置的,兩三天傳一代,長得很旺。后又從G內購買一株時間較長的,要七天傳一代,而且很嬌氣。
    3、MA891 鼠乳腺癌細胞:這種細胞比較特殊的是很難消化,容易消化成一團一團的,如果胰酶的量比常用的多三分之一充分預熱并放入培養箱中消化就會好的多。傳到15-20代細胞就易長成團,從此生長緩慢,形態改變,需要復蘇重養。

    95-D細胞的傳代:
    shou先要把0.25%的胰酶和培養液在37度水浴20~30分鐘(預熱). 從培養箱中拿出培養的細胞瓶(一般我是讓它長到90%幾再傳代的),吸去培養液,可用PBS洗兩遍.也可不洗.加入適量0.25%胰酶消化(試瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),讓它都浸濕細胞就可以吸去了.等個三十秒就在手上拍打,不要太用勁.就可以看到細胞脫落了,再加入3毫升左右的培養液吹打(這時加的培養液不要太多,否則難吹打成單個細胞!),制成細胞懸液,再傳**消毒的培養瓶中(我一般是1傳三,三天后又可以傳代了)再加入適量培養液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培養箱中培養.
    在操作過程中要有酒精燈的,瓶口,鑷子等可在火上過一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.無菌觀念要強!

    胃癌細胞MKN28和AGS:
    80%-90%confluency,吸棄原培養液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125%胰酶(10cm)-->轉動培養盤,保證整個盤面都被trypsin液潤過->37度消化5-10min-->以完全培液(RPMI1640+10% FBS-->吸打,1:5接種,前后左右搖晃培養盤,細胞均勻后放入培養箱培養(5%CO2 ,37度,24h一個周期#p#分頁標題#e#

    L929細胞:
    是一種貼壁細胞,貼壁后繁殖迅速,約3-4天傳代。切記:不要等到細胞貼的太滿,約70-80%即可傳代(細胞傳代時不能長的太滿,70%-80%就可以傳了BSZLY2003)。否則細胞容易聚團,再想將其打散很不容易,并且打散后細胞的狀態也不好了。我用的消化液是EDTA,新配的感覺特好用,胰酶也用過,但不如EDTA好用。以下傳代方法同樓上各位朋友。
    另外還有一點建議:細胞傳代之前用75%酒精棉球擦一擦手。細胞培養瓶打開前也要擦一下,可以降低污染的幾率。

    SP 2/0:
    是小鼠骨髓瘤細胞株,貼壁生長,科室給學生開實驗就用此細胞,所用培養基為1640,用小牛血清,濃度15%生長較好。培養孵箱為37度,5%的CO2。
    開始將復蘇的細胞傳到小培養瓶(如25ml),由于細胞分泌各種因子及細胞間的相互作用,因此生長較快,1-2天就可進行傳代(當然要達到80-90%的融合)。
    消化采用0.25%的胰酶,在顯微鏡下觀察,看細胞形態變圓,而且細胞間界限明顯后,或有極少數細胞漂浮起來就可終止消化。
    吹打時,動作要輕、快,而且吹管中要吸滿液體,這樣就不會產生氣泡,吹打按一定的順序進行,將瓶子徹底吹打,尤其是邊緣和角落。
    傳代,先將此瓶細胞只傳到一個大瓶中,以保證細胞的數量,小瓶也可保留,繼續培養。這樣3-4天又可進行傳代。

    mcf-7細胞株:
    本人的細胞株購自武漢中G典藏物培養中心(美GATCC株亞型),培養基是MEM, 10%的小牛血清(購自杭州四季青公司)。傳代要看細胞數的多少,一般來說10%的細胞,要5天左右,如果90%融合的細胞一傳2,3天子代細胞即可傳代。傳代:偶用的是25ml培養瓶,吸出培養基,6mlpbs沖洗3次,加入0.25%的胰酶2-3ml,胰酶均勻蓋滿瓶壁,消化2-5min左右(可以同時振搖),細胞縮起變圓,浮起,加入培養基2-3ml,不用太精確,吹打成單細胞懸液分瓶即可。室溫下消化即可,因為是成纖維細胞,較為耐受胰酶,消化時間稍長亦可,要注意mcf-7細胞是一種腫瘤細胞,生長規律性差,很容易不均勻,要注意吹打的充分性

    HSC-T6(大鼠肝星狀細胞系):
    棄培液-->以D-Hanks'液洗兩次-->0.05%胰酶消化-->鏡下觀察細胞變圓(約5分鐘)-->以完全培液(DMEM+10% FCS)終止反應-->吹打,1:3 - 1:4接種,然后繼續培養。
    該細胞系生長速度很快,所以采用1:3 - 1:4接種,而且換液間隔不要超過48h,否則細胞容易脫落下來。

    血液病細胞。
    如Molt-4,Hl-60等:這些細胞的特點是懸浮生長,傳代方便,而且適應能力強——————好養!
    當細胞生長到約2—8×10(6)后,即可認為進入對數生長期,此時傳代好,一般控制在2-5×10(6)之間**好,此時狀態**好。
    傳代方法:(傳代前的消毒處理略)
    直接在細胞懸液中加入一定比例的培養基。比例是根據您的實驗時間安排而定,此細胞一般24小時左右可以增長一倍數量,因此,如果現在的濃度為4,您明天要實驗,則可1:1傳,————2×10(6)。明天同一時間大概就是4左右。
    hl-60細胞:生長迅速,必須每天觀察,因此如果明天您要4×10(6),今天為4,就必須以1:2~3的傳。否則明天就已經因濃度太大而不易實驗。
    因是懸浮細胞,所以觀察時以大小,圓不圓,顆粒多少,成團情況,培養基顏色來觀察
    vero(非洲綠猴腎cell):貼壁細胞,以25ml小方瓶為例,培養液用的是MEM。
    MEM的配制:10%小牛血清,1%雙抗,3%谷氨酰胺,1~1.5%NaHCO3.
    傳代方法:
    1.倒掉培養液,如果細胞臟的話可用PBS洗兩次,否則不用。
    2.胰酶0.25%2ml消化1~3分鐘,容易消化.
    Molt-4:
    3.倒掉胰酶,加MEM9~12ml,將貼壁細胞搖**懸浮,并用吸管吹勻,一傳三或一傳四。
    4.放置37度,5%CO2孵箱

    Jurkat細胞(人外周血白血病T細胞):是一種懸浮細胞:
    1、培養液:RPMI1640,15%小牛血清,2%Na2CO3,1%HEPES,青霉素100IU/1ml,慶大霉素100IU/ml;
    2、培養條件:5%CO2,37度,30%濕度;
    3、細胞復蘇:要快速將凍存管放入37度水中,不斷輕輕搖晃,直到細胞完全溶解,加入10ml左右的培養液,800~1000rpm,10分鐘離心,之后倒掉液體,加入新的培養基就可以進行培養了;
    4、細胞培養:起初進行傳代時由于細胞剛剛復蘇,長得比較慢,所以可以3~4天傳一代,傳過兩代后,一般2~3天傳一代,每次傳代后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態,在傳過幾代合適的時候可以進行實驗。
    5、細胞凍存:1000rpm離心后,棄去液體,加入含有15%DMSO的凍存液,按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘〕→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-80℃ 1小時)→液氮。
    6、我在做細胞培養時的一些小經驗:
    (1)細胞培養箱在每使用1個月**好用酒精擦洗一次,這樣可以減少污染;
    (2)雖然說加樣器放在紫外下照射會不準,但我們還是丟了一把1ml的加樣器在超凈臺,沒有拿出來過,我想這樣也許會減少污染;
    (3)小牛血清我們用的是G產的,所以在一開始的時候加了15%的小牛血清,但細胞總是長不好,后來摸索條件,把小牛血清的量調到了20%,細胞生長旺盛;
    (4)HEPES雖然貴點,但加上去后細胞會長的不錯;#p#分頁標題#e#
    (5)在超凈臺操作前要用0.1%的新潔爾滅或75%酒精擦手

    MCF-7細胞:
    細胞放在顯微鏡下觀察,細胞無污染、退縮,等其長滿培養瓶約70%-80%時即可進行傳代操作,具體步驟如下:
    1. 打開瓶蓋,棄上清,2.D-HANK‘S夜(以50ml培養瓶為例,下同)2吸管清洗后棄之;3.加0.25%胰酶2吸管;4.輕搖晃后置入37度溫箱;5.3-5分鐘后置顯微鏡下觀察,見細胞胞質退縮,變圓;6.吸去胰酶,加含10%FCS的RPMI1640 3吸管;7.用洗管吹打,見細胞脫落,培養液變混,即可吸出加到新的培養瓶中。
    注意事項:若胰酶消化超過時間,見細胞已漂浮,切不可直接倒去上清,可直接加等量的含10%FCS的RPMI1640,吹打后加到離心管中離心5分鐘,再棄上清,加入培養基進行傳代

    BALB/c-3T3:小鼠成纖維細胞。
    消化過程:倒掉培養基——向培養瓶中加入少量37度預熱的0.25%胰酶,轉動培養瓶使胰酶浸過瓶底,倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶,加入量以能覆蓋細胞為宜,1分鐘后倒掉胰酶——將培養瓶置于37度孵箱中——顯微鏡下觀察,細胞開始變形時以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成單細胞懸液,1:2~1:3接種,繼續培養。

    SKOV3細胞傳代方法:

    自CO2培養箱取出培養瓶->超凈工作臺中,以吸管輕輕吹打有細胞的瓶壁,去除生長不好的細胞-->棄去培養液-->加0.04%&<46; EDTA數滴 (用0.02%的EDTA不易消化掉) ,浸過細胞-->置37℃培養箱10min&<46;左右-->取出,倒置顯微鏡下觀察,細胞變圓回縮,但又未自瓶壁脫落--&<46;>超凈工作臺中棄去EDTA->加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養基--&<46;>吸管吹打后,1:2或1:3接種。&<46;

    293細胞的傳代:
    通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在細胞約80%匯合時傳代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶(前提是用10%以上濃度的血清DMEM培養液)加上胰酶直接拍打**細胞脫落加入少許培養液中和后分瓶然后補加培養液 5%CO2孵箱 37度培養效果不錯

    HK2的傳代(人腎近曲小管上皮細胞):
    以50ml培養瓶為例
    1、細胞貼壁生長,長滿瓶底80%時,膠頭滴管移去培養液,可輕輕吹打,移液時不留培養液殘余
    2、加0.25%胰酶1ml消化37℃約2min,鏡下可見細胞基本圓形脫落,加含血清培養液2ml中止消化,反復混懸
    3、移入離心管,1200g,5min
    4、棄去上清,加入新培養液5ml,再次吹打混懸細胞,按需要分入新的培養瓶,鏡下可見散在分布圓形細胞
    5、入37℃5%CO2孵箱,半天即可再貼壁

    caco-2(人結腸癌上皮細胞):
    將Caco-2 細胞培養于高葡萄糖(的DMEM培養基中( 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺(L-glutamine), 培養液含青霉素( penicillin)10,000U/ml-鏈霉素(streptomycin)10,000ug/ml, 10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)),長于T-75組織培養曲頸瓶中,通入5%CO2(相對濕度90%),置37℃培養箱中培養。培養介質2~3天更換一次,當細胞達到90%融合后,以不含鈣,鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后與胰酶(0.25%)—EDTA(1mM)于37℃一起孵育**分離(約5~10分鐘)。吹打細胞使之脫落,置離心管中1000rmp離心5分鐘。細胞重新懸浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配**新培養瓶中。即完成傳代。

    Bel7402和ECV-304:
    37度,5%CO2培養箱。
    消化前所用物品75%酒精擦拭后放到超凈臺上,紫外照射30min,同時胰酶和1640培養液(10%小牛血清,杭州四季青)75%酒精擦拭后放入37度培養箱平衡,進無菌室開始傳代時取出。來蘇水托地,整個房間紫外消毒30min。開風淋30min(時間寧長勿短啊,有一次弄得我的臉暴皮!半個月才緩過來)。Bel7402通常都是棄培養液(我通常是倒,覺得用吸管次數多會增加污染的機會,而我老師意見正好相反,郁悶?。?,加入少量胰酶清洗,棄去后,加入胰酶2-3ml,培養箱內放置3min左右,取出,加入培養液中和胰酶,輕輕吹打即可。

    ECV-304培養條件同時。操作的時候步驟基本相同,只是加入胰酶消化的時間比Bel-7402稍微長1-2min

    卵巢癌的細胞:
    包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA,幾種細胞的特性不完全一樣,但是我的傳代的步驟是基本一致的:細胞生長**80%匯合時傳代,先倒掉培養液,加預先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml(100ml培養瓶)后輕輕搖晃數次后倒掉,加0.25-0.35%的胰酶2ml,并使其分布均勻(這一點很重要,一定要注意工作臺是否平整,否則容易造成胰酶分布不均勻而細胞消化不同步),待細胞間隙變大時終止消化,加含10%血清的培養液(我用的是1640)4ml輕柔吹打,再按照需傳代的比例(1:2或1:3)補足培養液后分裝**2-3個培養瓶中。若細胞碎片較多,可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養液吹打后500rpm離心5min,再用培養液重懸分瓶。消化所需的具體時間依細胞的種類和狀態而定,也和細胞的匯合程度有關,一般是80%匯合時**容易消化,若細胞長得太滿,消化時間要適當延長,必要時可以將培養瓶移**培養箱內消化。另外,一次性培養瓶要比玻璃培養瓶所需的消化時間稍長。
    胰腺癌細胞我所養的是CAP,
    感覺不太好伺候,尤其是傳代時很困難。我一般是在倒掉培養液后,加生理鹽水或PBS沖洗,而后加一次胰酶作用3-5分鐘,倒掉胰酶,再加2-3ml新的胰酶繼續消化,這樣加兩次的效果好一些,但是吹打的時候還是很困難,總感覺細胞的貼壁能力太強了,明明看見細胞已經變圓了,可就是吹不下來?,F在想想可能在胰酶中加EDTA會好一些。#p#分頁標題#e#
    CHO細胞:中G倉鼠卵巢細胞。
    1、培養液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清,青霉素+鏈霉素。消化時用0.25%胰酶。
    2、我都是1640配營養液時現加血清和雙抗,血清分裝后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉,沒發現血清有沉淀現象??傮w積100ml的培養液:90ml1640+10ml牛血清+1ml雙抗,無其他物質了。培養過程中沒發現有什么問題。
    3、傳代時,先吸掉培養液,我都不用倒掉的方法,怕由于瓶口而污染,都是慢慢吸管吸出的。然后培養液略微沖洗一下,加胰酶,倒置顯微鏡下見80%細胞變圓后,吸出胰酶,培養液終止消化。吹打下細胞,按所需稀釋比例傳代。我現在的CHO細胞狀態不是很好,但是瘋長,不知道為什么。所以每次傳代時,我都是留一滴足夠,差不多能稀釋20倍了。不知哪個戰友也養CHO細胞,多交流。

    小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的消化及傳代:
    RAW264.7因是單核巨噬細胞其生物學特性就是貼壁特別牢,普通的方法根本就不可能將它消化下來,這也是養這種細胞**頭痛的問題?,F將我的一點心得,簡介如下:
    消化液:0.5%胰酶、0.2%EDTA,實驗前加溫到37度
    以50ml培養瓶為例:1、細胞貼壁生長,長滿瓶底80%時,棄去培養液,加D-HANKS 漂洗兩次;2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml,消化37℃約2-5min,鏡下可見細胞基本圓形回縮即中止消化,棄消化液加D-HANKS 漂洗兩次;3.加入新培養液10ml復吹打混懸細胞,按需要分入新的培養瓶;4. 入37℃5%CO2孵箱,幾小時后即可再貼壁。

    SK-BR-3(乳腺腺癌細胞系)的傳代方法:
    剛開始養SK-BR-3時,細胞狀態不是很好,貼壁也不均勻,于是開始想辦法,考慮是不是吹打的不夠,或是傳得過多,或是其它的什么,后來發現的確如此,細胞的生長狀態與傳代的方法有很密切的聯系。

    我的傳代方法是:
    以50平方厘米培養瓶為例,待細胞長滿瓶底70%-80%
    1 吸除或倒掉瓶內舊培養基。
    2 PBS 5ml加入培養瓶,輕輕晃動培養瓶,讓PBS流遍細胞表面,倒掉。
    3 PBS 5ml加入培養瓶重復洗一次,倒掉。
    4 加入1ml胰蛋白酶消化液,輕輕搖動培養瓶,使消化液流遍所有細胞表面,然后置37度5%的二氧化碳培養箱放置5分鐘,在顯微鏡下觀察,發現細胞脫壁、變圓即可。
    5 加入含血清的培養基5ml中止消化,吸取瓶內培養液,反復輕輕吹打瓶壁細胞,確保所有的瓶底都要吹打到。
    6 吸1/3**1/4的細胞懸液接種**新的培養瓶,然后加8ml的新的細胞培養基,置37度5%的二氧化碳培養箱完成傳代。

    飼養層細胞STO的傳代:
    1.當細胞鋪滿整個平皿(100mm)后,吸棄舊培養液,10mLPBS洗一遍
    2.0.25%胰酶(預熱20分鐘左右)2ml消化,輕輕搖晃,直**肉眼見單層細胞呈塊狀脫落(或在顯微鏡下觀察細胞之間分離),立刻加5ml(DMEM+10%FBS)終止消化,輕柔吹打8-10次成單細胞。
    3.離心1000rpm*5min,棄上清,加DMEM+10%FBS輕柔吹打。
    4.將細胞懸液1:4傳到100mm細胞培養皿中,每個皿加10ml(DMEM+10%FBS)培養液,正常情況下2-3天就可以長滿,期間不用換液。
    小鼠ES-R1細胞系傳代:
    因為我們用飼養層細胞鋪皿而不是明膠包被,所以傳代之前必須處理飼養層細胞。
    1.飼養層細胞STO處理:當STO鋪滿平皿后,向培養液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作時不要接觸,作用是抑制STO增殖),輕輕搖晃平皿,保證絲裂霉素分布均勻,放置于培養箱中處理2h后,吸棄培養液,10mlPBS洗兩遍(目的是把mitomycinC洗凈),0.25%胰酶消化,5ml(DMEM+10%FBS)終止,離心1000rpm*5min棄上清,加DMEM+10%FBS后吹打均勻,種到新的100mm細胞培養皿,補齊培養液**10ml。置于培養箱中過夜。
    2.第二天早上傳干細胞:
    (1)吸棄舊培養液,10mlPBS洗一遍,2ml 0.25%胰酶消化,邊消化邊輕輕晃動培養皿,4-5min后鏡下觀察發現發部分細胞脫落,成小的細胞團塊,加8ml DMEM+10%FBS終止消化,輕柔吹打。
    (2)然后將液體轉移到15ml塑料離心管中,靜置10-15min,吸棄上清,加2mlES培養液。
    (3)將滴管在酒精燈下拉成非常細的玻璃管,吹打1-2次,盡量將ES吹散
    (4)將前**鋪好的STO的培養液吸棄,換成10ml的ES培養液(操作要小心,不然STO很容易脫落),再把塑料離心管中的ES1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的STO皿中,前后左右垂直晃動幾下,使干細胞分布均勻,置于培養箱中,每天換液,兩到三天傳代。
    應該注意的問題:
    1.STO不管是在ES傳代還是換液過程中都可能因為加液體速度過快而脫落,所以**好靠近培養皿壁先一滴一滴加,避免液體直接打在STO上。
    2.玻璃管拉得盡量細一些。
    3.一定要把mitomycin洗干凈

    HepG2細胞株的傳代經驗:
    shou先在倒置顯微鏡下觀察生長融合達80%,不需要長滿,就準備傳代。倒掉舊的培養基,再用已經高壓滅菌過的PBS洗1-2次,我用的是25平方厘米的培養瓶,加入1毫升已經配制好的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過濾,再用一次性過濾器過濾除菌,再分裝成1ml的小包裝,剛好每次用完一個,避免每次反復凍存,會使胰酶的活性下降),加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化,一旦發現細胞開始變園收縮,大約1-3分鐘時間,必要時可以吹打幫助細胞分散,就立即加入培養基中和胰酶,如有EDTA**好要離心(800rpm,5min),棄上清夜,再加入完全培養基吹勻,再分瓶,一般一瓶可以分2-3瓶。放入5%的CO2培養箱,37度培養24小時后觀察。#p#分頁標題#e#

    hela細胞的培養條件為:
    高糖DMEM培養基,100ml/l胎牛血清;培養液中一般血清含量為10%
    傳代步驟: 1.倒去細胞培養液(對于小口的培養瓶可采用頃倒方法,對于培養皿,必須用吸管吸出)
    2.吸取適量的PBS加入培養瓶中,輕輕振蕩后棄去重復一次,以清于血清成分,
    利于胰酶消化
    3.加入適量0.25%胰蛋白酶(一般100mm培養皿可加入1ml,15cm培養瓶加入5-8滴)轉動培養瓶,使其濕潤整個細胞房,高溫下消化2-3分鐘。
    翻轉培養瓶,肉眼觀察細胞單層,見細胞單層薄膜出現針孔大小空隙時即可頃去消化液,如消化程度不夠可延長消化時間,或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如見大量細胞片裝脫落,已消化過頭,則不能頃倒消化液而直接進行下一步操作
    4.加入適量培養液終止消化
    吸取瓶中培養液反復沖瓶壁上的細胞層,**全部沖下輕輕吹打,混勻,成細胞懸液取樣計數,調整細胞濃度為5′10 /ml
    15cm培養瓶培養時,吸取1ml細胞懸液加到新培養瓶中,加入4ml培養液,蓋好,置37°C孵箱中培養。
    傳代的天數要以HELA細胞的生長密度為基礎,細胞密度大了就要傳,應該每天觀察HELA細胞,注意其生長狀態.HELA細胞的生長分5期:
    游離期
    細胞經消化分散后,由于愿生質收縮及細胞彈性,細胞成圓形,折光性強,呈懸浮狀態。
    吸附期
    接種24小時后,由于細胞的附壁特性,開始貼壁,圓形細胞變成延展狀態。
    繁殖期
    細胞快速生長、分裂,形成細胞島直**細胞單層。
    維持期
    細胞形成單層后生長與分裂減緩、折光性減弱,細胞內顆粒增多,由于代謝物的積累,CO2增多,培養液變黃。
    衰退期
    如不及時換液和傳代,由于營養缺乏、代謝物積累,細胞內顆粒進一步增多,立體感差,細胞皺縮、脫落、逐漸衰老死亡。
    應該在其維持期和衰退期及時換液.一般而言是4天換一次液.
    祝你實驗順利!

    S180腫瘤細胞的,
    S180腹水型腫瘤細胞平時可以在小鼠腹腔中轉種傳代.我們科室保種時就這樣的.
    在有的試驗時需在培養瓶中培養一段時間,由于其增殖較快,培養時密度不宜大,一般10*5/ml就夠了;通常2天就需換一次液,由于其是懸浮細胞,無須消化,直接離心去上清,PBS洗滌,用含10%小牛血清的RPMI1640培養液就可以了.其要求條件相對較底,一般培養室都能達到.
    我平時還養小鼠的淋巴細胞,我們養的是混合淋巴細胞,不是單一的細胞株(或系),主要特點是如果需要傳代培養要加IL-2(出于經費考慮,我們就用人源IL-2,因為IL-2具有沿種系普向上約束性,而鄉下無約束性)50~100u/ ml,換液時可以離心去上清,可以用PBS洗滌兩一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事項同一般的培養.

    小鼠成肌細胞C2C12和人橫紋肌肉瘤A204細胞的消化傳代方法
    供大家參考:
    1)細胞消化液的配制及存儲:我采用的是0.25%Trypsin+0.05%EDTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分裝成4-5ml/tube,于-20度冰箱中儲存.
    2)消化前的處理:當細胞生長**亞融和狀態需要傳代時,提前半小時將配好的消化液放在細胞培養孵箱中預熱,同時將配好的高壓無菌的D-Hank's液也進行預熱.
    3)消化細胞:將預熱的D-Hank's液洗細胞2次,2ml/25cm2,然后再加入預熱的消化液,作用3-5min,并反復振蕩,鏡下觀察.當細胞被消化成單個圓球狀時,加入等體積的培養基中止消化,然后反復吹打,將消化后的細胞懸液,全部吸出后置于離心管中離心,1000rpm,10min.
    4)傳代接種細胞:離心完畢后,棄去上面的上清,加入新鮮預熱的培養基,并計數,按要求接種的密度接種到新的培養瓶中即可.
    這種方法的優點是:細胞消化徹底,損傷小,接種均勻,易于控制密度等.
    hepa1-6和p19細胞。
    hepa1-6是小鼠肝癌細胞,p19細胞是小鼠畸形胎瘤細胞,前者須用10%胎牛血清的DMEN養,后者須用10%胎牛血清的FD養,且經常在傳代初期出現生長狀態不好,要反復洗滌后換液,多觀察。

    Ecv304細胞的培養
    Ecv304細胞也很好培養.用含有10%小牛血清的DMEM培養,一般2-3天長到80%即可傳代,傳代是吸去培基,,用PBS沖洗,加入0.05%的胰酶+0.02%的EDTA,37度消化1分鐘,加含有10%小牛血清的DMEM終止消化,吸管輕輕打散細胞,然后加培基放入37度二氧化碳培養箱中培養即可.
    小鼠肝癌H22體內傳代的詳細步驟:
    1.腹腔種植小鼠肝癌H22細胞后第5-7天時,將小鼠頸椎脫臼處死,于75%酒精浸泡1-2分鐘或腹部消毒。
    2.于無菌條件下用5 號針頭注射器抽取腹水,并置于10~50 ml離心管內,用生理鹽水(NS) 10倍稀釋,吸管充分吹打均勻,1 000 r/min-1離心5#ml 7 min,傾出上清,按一定比例加入生理鹽水,配制成瘤細胞懸液5-10*10^7/ml,0.2 ml/只,接種到小鼠腹腔。
    3.為簡單起見,也可將抽取的腹水用生理鹽水做簡單稀釋(1:2~1:4),0.2 ml/只,腹腔傳代。
    4.下次傳代時,重復以上步驟即可。小鼠肉瘤S180腹腔體內傳代同上。

    H22小鼠肝癌細胞株
    是腹水型細胞株,懸浮生長。液氮冷凍保存。使用時取出復蘇,用1640加10%新生牛血清培養,三天后取液計數成1*108濃度,取0.08ml注入小鼠腹腔,7天左右腹水可用,一般要低速離心去掉巨噬細胞等混雜細胞,腹水得到的細胞比培養瓶中生長的細胞活力高,皮下接種成瘤率為100%。本法傳代可靠性高,細胞活力強,致瘤率高。#p#分頁標題#e#

    神經膠質細胞傳代經驗:
    1、倒掉培養液,用D-HANKS洗兩次
    2、加入0.125%胰酶/0.02%EDTA(1:1),蓋滿瓶底為宜。
    3、將培養瓶放置顯微鏡下進行觀察,發現細胞間隙增大,突起回縮后豎起培養瓶,倒掉消化液。
    4、用D-HANKS洗一次,此時動作要輕
    5、加入完全培養液,輕輕吹打混勻,接種**培養瓶中。
    注意:
    1、0.125%胰酶/0.02%EDTA的PH值和溫度重要,即PH值(7.5),溫度
    (37℃)
    2、如果消化速度過快,細胞掉下來,也不要緊,加D-HANKS或完全培養液終止消化,離心1000r/min,10分鐘即可
    3、輕輕吹打

    大鼠肝癌細胞系CBRH7919
    是我G自己培養的細胞系,**初是用二乙基亞硝胺誘發的Wistar大鼠肝癌組織傳代而成。此細胞系增殖力很強。
    傳代方法:細胞長到90%以上,棄培養液->0.25%胰酶消化->消化時間1.5-2min->吸棄胰酶->加入1640培養液,10%胎(?。┡Q?>傳代(一般一傳三)
    如胰酶消化時間增加,可通過離心沉淀細胞后加入培養液傳代,但這樣增加傳代時間,而且該細胞系粘附性較強,離心后易形成細胞團,且不易分散。

    293細胞
    293貼壁很不牢,可以不加消化液直接吹打下來,但這樣下來的細胞容易聚成團,傳代后形態不大好看??梢韵鹊沟襞囵B液,以D-HANK‘S液輕輕沖洗,再加0.6ml 0.25%胰酶/0.01%EDTA,輕輕潤濕細胞后即可棄去,置于鏡下觀察,很快即可見細胞變圓,加入適量完全培養基終止,輕輕吹打即可。這樣細胞既不會消化過頭,又極盡吹散。

    膀胱癌 T24細胞(貼壁的)。
    心得如下:
    1、 T24長的非???,傳代一般1:5傳,每4天需要再傳。
    2、雖然是永生化細胞,也一定不要等細胞100%匯合再傳代,多次這樣細胞狀態不好,球形增加,還不容易洗掉。
    3、要用胰酶(0.25%)--EDTA(0.01%)混合消化液消化好些,一般1分鐘內呈球形,即可混懸細胞了。
    4、培養液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。
    步驟:吸凈培養液, PBS洗2次,加消化液室溫一分鐘左右,要在顯微鏡下注意觀察,不要過頭,球形后,吸掉消化液,加1毫升培養液,吹打混勻,1:5傳代。

    SMMC-7721,肝癌細胞株:
    1、 SMMC-7721開始長的比較慢,呈花瓣狀,成片后迅速增殖,細胞由于過密開始變小,如果不及時傳代,會清楚的看到細胞張成兩層,下層細胞大一些,上次呈圓形,小。
    2、3-4天可以傳代,傳代時稀釋度視情況而定,一般1:3 - 5
    3、用胰酶(0.25%)--EDTA(0.01%)混合消化液消化,消化時間較長,大約5分鐘,當細胞過多時時間更長,建議分兩次消化,既先消化下來的一部分倒出加培養液(培養液用10%小牛血清的1640)終止,剩下的細胞繼續加消化液消化。
    步驟:倒凈培養液,胰酶洗1次,倒盡,加胰酶消化液置于37度,在顯微鏡下注意觀察,細胞變圓后,倒掉消化液,培養液,吹打混勻,1:3-5傳代。

    293T,貼壁細胞:在消化傳代過程中,步驟如下:
    用滴管吸盡舊的培養液->用培養基洗一次->加入一定量的胰酶(已預熱)->顯微鏡下觀察,待細胞大部分變圓時,回到超靜臺->用滴管吸盡酶液->加入一定量的含血清的新培養液->反復吹打細胞->再置顯微鏡下觀察,直到細胞全部懸浮起來->吸出一部分加入新的培養瓶中->**后再補充加入一定量新的培養液,放入培養箱。
    可用含有血清的DMEM,也可以用含有血清的1640。

    HELF(人胚肺成纖維細胞),
    這也是一種貼壁生長的細胞,所以傳代培養時的大概方法沒有什么不同.但這種細胞貼壁貼得不是很緊,所以消化過程中有幾點注意事項(本人總結):
    1.當倒出原有培養液時,**好將培養瓶反過來,即有細胞的面朝上.
    2.如用EDTA消化,**好先讓其消化3分鐘,后每一兩分鐘看一次.
    3.每次看時不要太過晃動瓶子,以防細胞成片脫落.如果細胞成片脫落了就比較麻煩了,因為細胞已經脫落,就不得不終止消化,但實際上細胞與細胞間的連接并沒有完全斷開,吹打也分不開,那樣分出來的細胞也就成團,則不利于細胞貼壁及生長.
    4.如果在終止消化前有細胞脫落,不要浪費,先加Hank's液終止消化,然后離心,收集細胞,再讓其生長.
    5.細胞生長狀態好時,一般5-7天可以長滿,其間換一次液就可以了.
    6.但我也遇到過生長不太好的情況,細胞長了12天才長滿,且其中有幾天幾乎沒長或出現大量黑色死細胞團,這時不要放棄,只要活細胞不是太少,沒有關系.之所以長的慢或有死細胞,大概是消化時EDTA的損傷造成的,細胞恢復活性需要一定時間,且一旦活性恢復,細胞將長得很快.


    人肝癌BEL-7402細胞傳代步驟:
    1. 棄去舊培養液(可用巴氏吸管吸去,也可直接翻轉培養瓶,使培養面朝上,直接倒掉培養液)。
    2.PBS沖輕緩漂洗細胞兩遍,盡量洗去殘余血清,棄PBS液。
    3 加0.25%胰酶(以蓋滿瓶底為標準)于37度條件下消化,倒置相差顯微鏡下觀察,細胞解離程度以細胞突起回縮,細胞間隙增大,細胞近乎縮成圓形為準。
    4.直接加含血清的1640培養基(或血清)終止消化。
    5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細胞,動作不宜過猛,防止起泡產生。
    5. 離心5分鐘(1000轉/分鐘),去上清。加入PBS液吹打混勻,再離心一遍。
    6. 用含10%小牛血清的1640培養液重懸細胞,按1:3傳代!#p#分頁標題#e#
    7.補加培養液**所用培養瓶容積的1/10為準。
    8.送孵箱培養。
    小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的消化及傳代,
    RAW264.7因是單核巨噬細胞其生物學特性就是貼壁特別牢。
    我得操作如下:
    實驗前將DPBS及DMEM加溫到37度
    使用Flask75培養瓶:
    1、細胞貼壁生長,長滿瓶底70%時,棄去培養液,加DPBS10ml漂洗一**兩次;棄去
    2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher輕輕刮即可,離心后去除DPBS.用DMEM培養液10ml復吹打混懸細胞
    3.分入新的培養瓶;
    4. 入37℃5%CO2孵箱,幾小時后即可再貼壁。

    卵巢癌細胞SKOV3
    貼壁生長,傳代步驟:
    1.倒掉舊培養液,盡量倒凈。
    2.如果是50ml的培養瓶,加入約1ml0.25%胰酶中和殘留培養液,倒出。也可用D-HANKS液洗一次,可以節約胰酶。
    3.再加1ml0.25%胰酶消化,本人體會,新開瓶(指分裝的小瓶)使用的胰酶消化能力強,可以減少用量**0.5-0.8ml,已用較久的胰酶如用少了就不管用。
    4.鏡下觀察,如果80%以上細胞都回縮變圓,立刻將培養瓶豎起,防止過度消化。
    5.倒掉胰酶,用含10%小牛血清1640培養液5ml加入瓶內,按順序輕吹打,如瓶底由模糊變透亮,說明細胞已從瓶壁吹離。
    6.此種細胞生長較快,所以一般按1傳5-6傳代,按瓶數補足培養液,吹勻后分別接種到新瓶中。
    7.根據培養液顏色變化所提示的酸堿度變化,一般2天左右換液一次。
    人臍靜脈內皮細胞株ECV304:在含體積分數為10%胎牛血清(FPS)的RPMI1640培養液,37℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度條件下培養,3-4d換液傳代一次。實驗時采用對數生長期細胞。傳代時先倒掉舊培養液,用pbs5ml洗兩遍,再加入0.25%的胰酶+0.01%edta,加入的量以能覆蓋瓶底為準。加入后輕輕搖晃培養瓶使液體覆蓋瓶底,然后大約半分鐘左右看一次,對著光源觀察瓶底細胞黏附面是否有裂縫(如有則在顯微鏡下可見細胞之間出現間隙且有大部分細胞呈現圓形),倒掉,加入含低濃度血清培養液,然后吹打瓶底各處使細胞脫落。離心后去除上清液,加全培,再分4瓶,補加培養液。這樣操作步驟可大大簡化,不需要將培養瓶拿出拿進操作臺了.
    附:消化緩沖液(0.25%)胰蛋白酶:胰蛋白酶干粉1.25g,0.1gEDTA,溶于50ml 10×D-Hanks溶液中,調節**PH 7.6,定容**500ml,22um濾膜過濾除菌,分裝后-20℃保存備用
     
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