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    細胞培養的一般過程

    一、準備工作
    準備工作對開展細胞培養異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻。
    二、取材
    在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的**培養稱為原代培養。
    理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養,實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養,分化程度低的組織比分化高的容易培養,腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理,盡快培養,因故不能馬上培養時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。
    由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
    三、培養
    將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。如系細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后,立即放入培養箱中,使細胞盡早進入生長狀態。
    正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無污染,培養基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。
    一般原代培養進入培養后有一段潛伏期(數小時到數十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養,將一瓶中的細胞消化懸浮后分**兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。
    培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
    四、凍存及復蘇
    為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—-196℃,將細胞收集**凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,**終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。
    復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
    凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
    培養細胞的細胞生物學 
    一、體內、外細胞的差異和分化
    1、差異:細胞離體后,失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響,生活在缺乏動態平衡的相對穩定環境中,日久天長,易發生如下變化:分化現象減弱;形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發生轉化獲得不死性,變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此,培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體,它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能,也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后,這種差異就開始發生了。
    雖然體外細胞與機體細胞存有差異,但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內相同(如體外培養的心肌細胞仍可博動),只從細胞遺傳學(Cyto-genetics)的角度看,離體細胞仍帶有全套的二倍體基因。細胞在培養中的表現,只不過是相應基因關閉/開啟引起的現象,這并非是**缺陷。恰恰相反,在培養的細胞中某些特定功能的喪失,可為該基因的表達與調控提供線索。
    2、分化;體外培養的細胞分化能力并未完全喪失,只是環境的政變,細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化關鍵在于是否存在使細胞分化的條件,如Friend細胞(小鼠紅白血病細胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血管狀結構,雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體,這些均屬于細胞分化行為。
    二、體外培養細胞的分型
    (一)貼附型:大多數培養細胞貼附生長,屬于貼壁依賴性細胞,判斷細胞形態時不能接體內組織學標推判定,僅大致分成以下四型:
    1、成纖維細胞型:胞體呈梭型或不規則三角形,中央有卵圓形核,胞質突起,生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間充質起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。另外,凡培養中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。
    2、上皮型細胞:細胞呈扁平不規則多角形,中央有圓形核,細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動,處于膜邊緣的細胞總與膜相連,很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。#p#分頁標題#e#
    3、游走細胞型:呈散在生長,一般不連成片,胞質常突起,呈活躍游走或變形運動,方向不規則。此型細胞不穩定,有時難以和其他細胞相區別。
    4、多型細胞型:有一些細胞,如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態,可統歸于此類。
    (二)懸浮型;見于少數特殊的細胞,如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。
    三、培養細胞的生長和增殖過程
    體內細胞生長在動態平衡環境中,而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器,生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后,則需要分離出一部分細胞和更新營養液,否則將影響細胞的繼續生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細胞特別是正常細胞,在體外的生存也不是無限的,存在著一個發展過程。所有這一切,使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。
    (一)培養細胞生命期(Life Span of Culture Cells)
    所謂培養細胞生命期,是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細胞在培養中生命期如何?這要看細胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細胞培養,在不凍存和反復傳代條件下,可傳30~50代,相當于150~300個細胞增殖周期,能維待一年左右的生存時間,**后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體,則生存時間較短;如培養的為其它細胞如肝細胞或腎細胞,生存時間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉化時,細胞的生存期才可能發生改變。對此以后將詳述。
    正常細胞培養時,不論細胞的種類和供體的年齡如何,在細胞全生存過程中,大致都經歷以下三個階段:
    1.原代培養(Primary Culture)期:
    也稱初代培養,即從體內取出組織接種培養到**次傳代階段,一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動,可見細胞分裂,但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的(Heterogeneous),也即各細胞的遺傳性狀互不相同,細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養基中進行培養時,細胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即細胞獨立生存性差??寺⌒纬陕始醇毎罕幌♂尫稚⒊蓡蝹€細胞進行培養時,形成細胞小群(克?。┑陌俜謹?。初代培養細胞多呈二倍體核型;由于原代培養細胞和體內細胞性狀相似性大,是檢測藥物很好的實驗對象。
    2.傳代期:
    初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續時間**長。在培養條件較好情況下,細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細胞性質,細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存,則需反復傳代以維持細胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10~50次左右,細胞增殖逐漸緩慢,以**完全停止,細胞進入第三期。
    3.衰退期:
    此期細胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細胞形態輪廓增強,**后衰退凋亡。在細胞生命期階段,少數情況下,在以上三期任何一點(多發生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細胞可能發生自發轉化(Spontaneous Transformation)。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱不死性,即細胞獲持久性增殖能力,這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite Cell Line),也稱連續細胞系(Continuous Cell Line)。在早期文獻中無限細胞系也稱已建立細胞系(Established Cell Line),現已不用。無限細胞系的形成主要發生在第二期末,或第三期初階段。細胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉化亦可用人工方法誘發,轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
    (二)組織培養細胞一代生存期
    所有體外培養細胞,包括初代培養及各種細胞系,當生長達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下,細胞數量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比**時要快)。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快,培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
    所謂細胞“一代”一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間,這已成為培養工作中的一種習慣說法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細胞一代中,細胞能倍增3~6次。細胞傳一代后,一般要經過以下三個階段:
    1.潛伏期(Latent Phase):
    細胞接種培養后,先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮,胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養細胞貼附慢,可長達10~24小時或更多;連續細胞系和惡性細胞系快,10~30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。#p#分頁標題#e#
    細胞貼附于支持物后,除先經過前述延展過程變成極性細胞,還要經過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅6~24小時;細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時,標志細胞已進入指數增生期。
    2.指數增生期(Logarithmic growth Phase):
    這是細胞增值**旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%~0.5%,初代細胞分裂指數低,連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%~5%。pH和培養液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力**好的時期,因此是進行各種實驗**好的和**主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下,指數增生期持續3~5天后,隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、**后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動,這種現象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無接觸抑制現象,因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發生堆積(Piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖發生接觸抑制,只要營養充分,細胞仍然能夠進行增殖分裂,因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大,培養液中營養成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養的枯竭和代謝物的影響,則發生密度抑制(Density Inhibition),導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應混淆。
    3.停滯期(Stagnate Phase):
    細胞數量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進入停滯期。此時細胞數量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養液中營養漸趨耗盡,代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代,否則細胞會中毒,發生形態改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態。在這種情況下,雖進行了傳代,因細胞已受損,需要恢復,**少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后,才能再用。結果反而耽誤了時間,這是在實驗中應特別注意的。
    建立細胞系或細胞株 
    各種已被命名和經過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株,都是一些形態比較均一、生長增殖比較穩定的和生物性狀清楚的細胞群。因此凡符合上述情況的細胞群也可給以相應的名稱,即文獻中常稱之為已鑒定的細胞(Certified Cells)。已鑒定的細胞可用于各種實驗研究和生產生物制品。當前世界上已建的各種細胞系(株)已難勝數,我G也建有百種以上,并在不斷增長中。
    一、體外培養細胞的種類和命名
    體外培養細胞的名稱,隨培養細胞技術的發展和細胞種類的增多而演變。**早采用的名稱為細胞株(Cell strain),以后又出現細胞系(Cell Line)一詞,兩者曾一度混用致概念不明確,導致文獻中也很混亂。我G也曾有類似情況,在我G尚未制定出統一名詞前,本書用的名詞基本參考Schaeffer,W.I.(1979)和G內有關會議、以及G內外雜志常用名詞為準。
    (一)初代培養
    初代培養又稱原代培養,即直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的**次的培養物。一旦已進行傳代培養(Subculture)的細胞,便不再稱為初代培養,而改稱為細胞系。
    (二)細胞系
    初代培養物開始**次傳代培養后的細胞,即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限,則稱之為有限細胞系(Finite Cell Line);已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系,稱連續細胞系或無限細胞系(Infinite Cell Line)。無限細胞系大多已發生異倍化,具異倍體核型,有的可能已成為惡性細胞,因此本質上已是發生轉化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性(或不死性),但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性;有的不僅有永生性,異體接種也有致瘤性,說明已惡性化。這兩種不同性質的無限細胞系,在G內外文獻中對這些名詞的應用上也常不十分嚴格。為概念上的明確,本書中對有惡性的無限細胞系采用“惡性轉化細胞系”一詞表示可能更妥。而對那些只具永生性而無惡性的細胞系,則用無限細胞系或轉化細胞系即可。當前流傳的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均屬這類細胞系。
    由某一細胞系分離出來的、在性狀上與原細胞系不同的細胞系,稱該細胞系的亞系(Subline)。
    (三)克隆細胞株
    從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群,稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀不同的細胞群,亦可稱之為亞株(Substrain)
    (四)二倍體細胞
    細胞群染色體數目具有與原供體二倍細胞染色體數相同或基本相同(2n細胞占75%或80%以上)的細胞群,稱二倍體細胞培養。如僅數目相同,而核型不同的即染色體形態有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期,故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同,二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代,人胚腎只有8~10代,人胚神經膠質細胞15~30代;如從老齡個體取可傳50則細胞生存期更短。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用,一般在初代或2~5代即大量凍存作為原種(Stook Cells),用時再進行繁殖,用后再繼續凍存,可供長期使用或延緩細胞的衰老。#p#分頁標題#e#
    (五)遺傳缺陷細胞
    從有先天遺傳缺陷者取材(主要為成纖維細胞)培養的細胞,或用人工方法誘發突變的細胞,都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型,也可呈異倍體。
    (六)腫瘤細胞系或株
    這是現有細胞系中**多的一類,我G已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成,多呈類上皮型細胞,常已傳幾十代或百代以上,并具有不死性和異體接種致瘤性。
    對已建成的各種細胞系或細胞株習慣上都給以名稱;細胞的命名無嚴格統一規定,大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式,均不宜太長,以便記憶和了解,今別舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考:
    HeLa:為供體患者的姓名(來源于宮頸癌)
    CHO:中G地鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary)
    宮-743:宮頸癌上皮細胞,1974年3月建立
    NIH3T3:美GG立衛生研究所(National Institute of Health)建立;每3天傳代,每次接種3×105細胞/毫升。
    二、建立細胞系(或株)的要求
    關于什么樣的體外培養細胞群,可被確認為是已被鑒定的細胞(Certified Cells),G際上也尚無統一的規定,一般依具體情況而定。在只用作初代培養細胞,只要供體性別、年齡等均一,取材部位及組織種類等條件穩定,做鑒定的項目無需很多,有幾項能說明細胞的相關性狀的即可。如能長期保存并可供其它研究室使用,特別是做反復傳代的細胞,習慣上有以下一些要求,并在刊物上報道時應加以說明。
    (-)組織來源
    應說明細胞供體所屬物種,來自人體,動物或其它;供體的年齡、性別、取材的器官或組織;如系腫瘤組織,應說明臨床病理診斷,組織來源,以及病例號等。
    (二)細胞生物學檢測
    應了解細胞一般和特殊的生物學性狀,如細胞的一般形態、特異結構、細胞生長曲線和分裂指數、倍增時間、接種率;特異性,如為腺細胞有否特殊產物包括分泌蛋白或激素等;如為腫瘤細胞,應力求證明細胞確系來源于原腫瘤組織而非其它,并仍保持性性,為此需做軟瓊脂培養、異體動物接種致瘤性和對正常組織浸潤力等實驗。
    (三)培養條件和方法
    各種細胞都有自己比較適應的生存環境,因此應指明使用的培養基、血清種類、用量以及細胞生存的適宜pH等。
    三、已建立細胞系或株的鑒定、管理和使用
    近些年,當一個細胞系或細胞林建成后,我G常通過組織**開鑒定會的形式予以鑒定,從學術角度考慮,此舉實非必要。按G際慣例,只要研究認真負責地把有關資料在雜志或刊物上報道,詳細介紹上述各項目即可。
    以前因未建立統一的細胞庫時,對已建立的細胞系(株)多由作者單位自行保管,有浪費人力、交流使用不便、細胞易污染和丟失等弊病。我G已初建成小規模貯存細胞機構,待獲進一步發展,這對我G細胞培養必將有更大促進作用。
    G際上美、英和日本等G已建有細胞庫;美G已有美G標準細胞庫或細胞銀行(ATCC)和人遺傳突變細胞庫(HGMR)、細胞衰老細胞庫(CAR)等,其中ATCC不僅是美G也世界**大的細胞庫。ATCC下屬有一組協作實驗室和一個由眾多**組成的咨詢委員會。ATCC也是美GG立癌癥研究所(NCI)和美G衛生研究所中(NIH)的資源庫,尤與NCI有密切的關系。ATCC也是世界衛生組織WHO的G際培養細胞文獻中心。ATCC現液氮凍存有3200個已經過鑒定的細胞系(1992),其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系;和來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株。ATCC接納來自世界各G已經鑒定的細胞予以貯存,同時也向世界各G的研究者或實驗室免費提供研究用細胞(做盈利性研究時收費。) ATCC接納入庫細胞時,必須符合其入庫標準, ATCC入庫細胞要求檢測項目如下:
    培養簡歷:組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?;虍惓=】禒顟B、細胞已傳代數等
    凍 存 液:培養基和防凍液名稱
    細胞活力:融解前后細胞接種存活率和生長特性
    培 養 液:培養基種類和名稱(一般要求不含抗生素)、血清來源和含量
    細胞形態:類型,如為上皮或成纖維細胞等,融解后細胞生長特性
    核 型:二倍體或多倍體,標記染色體的有無
    無污染檢測:包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等
    物種檢測:檢測同工酶,主要為G6PD和LDH,以證明細胞有否交叉污染以及反轉錄酶檢測
    免疫檢測:一兩種血清學檢測
    細胞建立者:建立者姓名;檢測者姓名
    以上為ATCC入庫基本要求,雜交瘤入庫標準尚有所不同,詳細情況請參閱ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”
     
     
     
     
    MTT測定CMC
     
     
    1. Fen細胞培養于含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中,在25cm2培養瓶中生長到接近匯合。用含0.05%胰蛋白酶,0.02% EDTA的PBS消化細胞5分鐘,洗滌后,用細胞培養液將細胞配成1×105#p#分頁標題#e#/ml。
    2. 取96孔細胞培養板,每孔加0.1ml細胞懸液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培 養箱中培養24小時,讓細胞帖壁。每孔加0.1ml效應細胞懸液,效靶比10:1到50:1,繼續培養4小時,讓效應細胞發揮殺傷效應。實驗中,設立只有靶細胞的無殺傷對照和只有 效應細胞的陰性對照,每種處理設3各復孔。
    3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培養液洗滌各孔 3次,洗去不粘附的細胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培養液和10μl 5mg/ml的MTT染液,繼續培養3小時。
    4. 用PBS洗滌2次,每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的異丙醇,室溫30分鐘,溶解形成的結晶。在570nm波長處,用酶聯檢測儀檢測各孔的光吸收值(OD)。
    殺傷活性(%)=(OD實驗孔-OD陰性對照) /OD無殺傷對照× 100
    MTT檢測細胞生長
     
     
    1.取96孔細胞培養板,每孔中加0.1ml含2×104~10×104靶細胞的培養液(含10%小牛血清的RPMI-1640培養液),在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2~3小時讓細胞帖壁(如果是懸浮細胞可直接進行下一步)
    2.用RPMI-1640培養液2~10倍遞次稀釋細胞因子標準品,根據情況2~5倍遞次稀釋待檢樣品,每孔加0.1ml稀釋的標準品和待檢樣品,每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個:3個陽性對照孔,每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的RPMI-1640培養液,3個陰性對照孔,每孔加0.1ml RPMI-1640培養液。在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24~48小時或預定的時間。
    3.吸去培養液,用PBS洗滌一次(如為懸浮細胞,應在吸去上清液前離心培養板)。
    4.每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4~6小時。
    5.每孔加0.1ml酸化異丙醇,也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化異丙醇,在振蕩器上振蕩混勻,讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度(OD)值,檢測波長570nm,參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖,比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
    腫瘤細胞培養方法簡介
     
     
     
     
    一、機械刮除法
    1.標記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位。
    2.刮除:棄掉培養液,把無菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無標記空間。
    3.用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細胞。
    4.注入培養液繼續培養,如發現仍有成纖維細胞殘留,可重復刮除**完全除掉為止。

    二、反復帖壁法
    1.待細胞生長達一定數量后,倒出舊培養液,用胰酶消化后,Hanks沖洗2次,加入不含血清的培養液,吹打制成細胞懸液。
    2.取編號為A、B、C三個培養瓶。shou先把懸液接種入A培養瓶中,置溫箱中靜止培養5~20分鐘后,輕輕傾斜培養瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液,再接種入B培養瓶中后,向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養。
    3.培養B瓶中細胞5~20分鐘后,按處理A的方法,把培養液注入C培養瓶中,再向B瓶補加完全培養基。
    三、消化排除法
    1.先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養基細胞一次,然后再換成新的混合繼續消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶,到半數細胞脫落下來后,便立即停止消化。
    2.把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養液置溫箱中培養,向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后,成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落,經過幾次反復處理,可能把成纖維細胞除凈。
    四、膠原酶消化法
    1.可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當發現成纖維細胞被除掉后,即終止消化。
    2.用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養液,繼續培養,可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈,可再次重復。
    細胞培養中的一些試劑
     
     
     
     
    一、紡錘體阻斷劑(Spindle inhibitor)
        在有絲分裂過程中,隨著紡錘絲的形成,染色體被牽引到一起難以觀察其形態。紡錘體的形成在于細胞質和紡錘體成分的粘度之間的平衡,因此,改變細胞質的粘度,即可破壞紡錘體形成,從而使得染色體均勻散開,且染色體縊痕區更為清楚。
        在培養中使用的紡錘體阻斷劑為秋水仙素,在終止培養前加入適量秋水仙素,使正在分裂的細胞停留在中期,以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的濃度范圍比較寬,一般使用濃度0.05—0.8微克/毫升,在終止培養前處理2—4小時。但在實際工作中需要借助濃度和處理時間來控制染色體的收縮程度。秋水仙素作用時間越長,被阻斷的中期分裂相越多,但是染色體也越凝聚和收縮,所以還視各實驗室經驗而定。
    二、低滲液(hypotonic solution)
        低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細胞生理條件的溶液,例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65M)、氯化鉀(0.075M)等。低滲效果取決于低滲液的化學組成、低滲的溫度和處理時間。低滲處理是憑借反滲透作用使細胞膨脹染色體鋪展,同時可使粘附于染色體的核仁物質散開,以便能在一個平面上觀察所有染色體形態。
        實驗室中一般選用0.075M KCl為低滲液(具體情況取決于實際操作,鑒于實驗的連續性和穩定性,本實驗室采用0.35%KCl),其優點有:①染色體輪廓清楚,可染色性強,染色時間短,②用于顯帶染色時能充分顯示帶型特點。
        低滲處理為37℃,15-25分鐘,以預實驗條件為準。
     三、固定液 
        固定液的重要特性是能迅速穿透細胞,將其固定并維持染色體結構的完整性,還要能夠增強染色體的嗜堿性,達到優良染色效果。
      單純的固定液一般難以達到這些要求,因此在實驗中使用兩種混和的固定液。由于Carnoyshou先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱的卡諾氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液(甲醇:冰乙酸=3:l)每次使用前需臨時配制,長時間放置影響固定效果,固定時間15分鐘**24小時,冰箱、室溫均可。必要時可改變甲醇和冰乙酸的比例,冰乙酸比例增加,利于細胞膨脹、染色體鋪展,但易導致細胞破裂、染色體散失。
    四、滴片
        滴片使細胞懸液從一定高處落在載玻片上,淋巴母細胞膜破裂,染色體分散開。載玻片可用冰片和干片,效果均好。滴片后需空氣干燥。
    五、Giemsa染色
        Giemsa染料不是一種單一染料,而是天青、伊紅、甘油和甲醇的混合物,配制后原液儲存。在常規染色中,并不比其他染料優越,但在顯帶技術中,卻是無可比擬的。
        Giemsa工作液在使用前臨時配制,濃度可在2.5-10%之間(原液2份加pH7.4磷酸緩沖液10-40份)。染色后,染色質呈紅色,細胞核是藍色。 
    超凈臺工作原理及使用方法
     
     
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    超凈臺的優點是操作方便自如,比較舒適,工作效率高,預備時間短,開機10分鐘以上即可操作,基本上可隨時使用。在工廠化生產中,接種工作量很大,需要經常長久地工作時,超凈臺是很理想的設備。超凈臺由三相電機作鼓風動力,功率145~260W左右,將空氣通過由特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成的“超級濾清器”后吹送出來,形成連續不斷的無塵無菌的超凈空氣層流,即所謂“高效的特殊空氣”,它除去了大于0.3μm的塵埃、真菌和細菌孢子等等。超凈空氣的流速為24~30m/min,這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染,這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作,保持無菌材料在轉移接種過程中不受污染。但是萬一操作中途遇到停電,暴露在未過濾空氣中的材料便難以幸免污染。這時應迅速結束工作,并在瓶上作出記號,內中的材料如處于增殖階段,則以后不再用作增殖而轉入生根培養。如為一般性生產材料,因極其豐富也可棄去。如處于生根過程,則可留待以后種植用。
    超凈臺電源多采用三相四線制,其中有一零線,連通機器外殼,應接牢在地線上,另外三線都是相線,工作電壓是380V。三線接入電路中有一定的順序,如線頭接錯了,風機會反轉,這時聲音正?;蛏圆徽?,超凈臺正面無風(可用酒精燈火焰觀察動靜,不宜久試),應及時切斷電源,只要將其中任何兩相的線頭交換一下位置再接上,就可解決。三相線如只接入兩相,或三相中有一相接觸不良,則機器聲音很不正常,應立即切斷電源仔細檢修,否則會燒毀電機。這些常識應在開始使用超凈臺時就向工作人員講解清楚,免除不應造成的事故與損失。
    超凈臺進風口在背面或正面的下方,金屬網罩內有一普通泡沫塑料片或無紡布,用以阻攔大顆粒塵埃,應常檢查、拆洗,如發現泡沫塑料老化,要及時更換。除進風口以外,如有漏氣孔隙,應當堵嚴,如貼膠布,塞棉花,貼膠水紙等。工作臺正面的金屬網罩內是超級濾清器,超級濾清器也可更換,如因使用年久,塵粒堵塞,風速減小,不能保證無菌操作時,則可換上新的。
    超凈臺使用壽命的長短與空氣的潔凈程度有關。在溫帶地區超凈臺可在一般實驗室使用,然而在熱帶或亞熱帶地區,由于大氣中含有高量的花粉,或多粉塵的地區,超凈臺則宜放在較好的有雙道門的室內使用。任何情況下不應將超凈臺的進風罩對著開敞的門或窗,以免影響濾清器的使用壽命。
    無菌室應定期用70%酒精或0.5%苯酚噴霧降塵和消毒,用2%新潔爾滅抹拭臺面和用具(70%酒精也可),用福爾馬林(40%甲醛)加少量高錳酸鉀定期密閉熏蒸,配合紫外線滅菌燈(每次開啟15分鐘以上)等等消毒滅菌手段,以使無菌室經常保持高度的無菌狀態。接種箱內部也應裝有紫外線燈,使用前開燈15分鐘以上照射滅菌,但凡是照射不到之處仍是有菌的。在紫外線燈開啟時間較長時,可激發空氣中的氧分子締合成臭氧分子,這種氣體成分有很強的殺菌作用,可以對紫外線沒有直接照到的角落產生滅菌效果。由于臭氧有礙健康,在進入操作之前應先關掉紫外線燈,關后十多分鐘即可入內。
    在超凈工作臺上亦可吊裝紫外線燈,但應裝在照明燈罩之外,并錯開照明燈平行排列,這樣在工作時不妨礙照明。若將紫外線燈裝入照明燈罩(玻璃板)里面,這是毫無用處的,因為紫外線不能穿透玻璃,它的燈管是石英玻璃,而不是硅酸鹽玻璃制成的。
    接種室內力求簡潔,凡與本室工作無直接關系的物品一律不能放入,以利保持無菌狀態。接種室內的空氣與外界空氣應**隔jue,預留的通氣孔道應盡量密閉。通氣孔道可設上下氣窗,氣窗面積宜稍大,需覆上4層紗布作簡單濾塵。在**工作之后,可開窗充分換氣,然后再予以密閉??傊?,既要清潔無塵無菌,又要空氣新鮮,適宜工作。覆在通氣窗上的紗布應經常換洗。但是上述種種措施只是理想的設計方案,往往不易全面做到,其實只要嚴格無菌操作手續,在門窗敞開的室內,有一超凈臺的保護,接種的污染率仍可控制在生產上可以容忍的水平。
    離心機轉數與離心力的換算
     
     

     
       RPM(revolution per minute)為離心機每分鐘的轉數;RCF(relative centrifugal field)為相對離心場,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數來表示。
       RCF與每分鐘的轉數RPM(r/min)以及離心機旋轉軸到離心管中間的距離,即平均半徑r(以cm表示)的關系為:
       RCF = 1.119 x 10-5 x (rpm)2 x r
     
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