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    細胞培養集錦

    一、消化與吹打
    版上很多朋友討論細胞培養問題,見到很多很好的經驗總結,這里說一些我個人的經驗,因為一些比較特殊的原因,我自己培養接觸過近300種細胞,常用于做實驗的,累積有百余種,可以說遇到過許多各式各樣古怪的細胞。這里挑細胞消化開始做我的**篇專題,并不是因為細胞消化**重要,而是近期看到大家頻繁討論這個話題,我就拋磚引玉,下面幾點拙見,可能與其它朋友總結的一些經驗有點出入,僅供大家參考。
    許多同學對細胞消化做了許多研究,得出了很多有價值的經驗,也見到很多人的困惑。其實細胞培養,尤其是細胞系的培養,就消化而言,不是太難,做得多了,善于總結經驗,就能把細胞越養越好。一般的程序步驟,細節操作,我這里就不講了,只講一些基本操作背后的知識,如果不對之處,歡迎指正,一起討論:
    1,其實jue大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可,吸去胰酶后,殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細胞(jue大部分1min不到)。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續這樣傳代,對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后37度消化。
    2,什么算是消化好了呢?不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細胞層,只要能移動了,多半呈沙壯移動,其實已經可以了,很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完全分離細胞,這是沒有必要的。一般能移動了,說明細胞與培養基質材料的附著已經消失了,細胞之間的附著也已經消失了,細胞已經獨立分布了(雖然沒有呈現很廣的離散分布)。這個時候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。細胞就是完全成單個細胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會聚集,這個是貼壁培養的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個特性,無論死活的細胞都是如此,你可以嘗試,準備100%的單個細胞懸液,貼壁后觀察細胞,仍然是幾個幾個細胞聚集在一起。一些懸浮培養細胞也是如此,容易聚集,不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細胞懸液(不要笑,這個是初養懸浮細胞的人常犯的錯誤,以為懸浮培養就是一個一個分開)。細胞只要能從基質上脫離下來,這個時候即使是成片的(比如Calu-3細胞),吹打不超過20次后(一般10次即可),成小規模聚集(10個細胞左右),是正常的,不要試圖再去延長消化時間,或者象有的同學那樣吹打1h,等待單細胞懸液出現。
    3,另一個帖子里提到一個比較復雜的四步消化法,這個挺有意思,我也是**次聽說,應該是網友自己發展出來的方法,很有參考價值。但我估計這個方法可能對付少數非常怪異的細胞才需要這么復雜的程序。我目前養過的近300株細胞里面,還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實是很好消化的細胞,不需要胰酶孵育即可,只是有點成片分布。不要以為成片分布是自己沒養好,這個視細胞而定。如果和標準形態不一致,那可能是自己沒消化好導致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚**完全吹打成單細胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細胞的特性,是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細胞之后會對你越來越不好。
    4,比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),就以colon cancer為例,比如HCT15, LS411和KM12,這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100 mm dish,一次**多加入500ul,就足夠了,一般我加300ul。即使這樣難消化的細胞,一般不超過5min,即可見細胞成片移動,就應該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候,比如tsDC細胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動。
    5,常規的細胞實驗(增殖,凋亡,遷移,分化之類的),受消化影響不是很大,如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話(難消化細胞例外)。但少數實驗,比如病毒包裝,對細胞代數,對細胞狀態要求極高。這個時候,胰酶消化,就是潤洗,都會對細胞包裝病毒的能力有影響,傳代次數一多,細胞包裝能力就會逐漸下降(當然也有其它因素影響包裝效率)。這個時候都不用胰酶消化,用一些鹽溶液(不是EDTA液)即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關酶的活性,來使得細胞脫離基質附著表面,但不切割任何蛋白。
    6,EDTA的作用。許多人不用胰酶,只用EDTA,或者用trypsin/EDTA聯合作用。這里要明白,trypsin切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白,而EDTA通過螯合Ca離子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA,或者對付特別難消化的細胞,添加多一些EDTA,就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間(如果10min還消化不徹底的話),而應該想其它辦法。
    7,PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌,是常見的操作,因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學問可以講,對于一些難消化細胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于jue大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞,不需要配制如此溶液。
    總結下來,雖然這個帖子是關于消化的,但其實消化并不是細胞培養的關鍵所在(雖然很重要),關鍵所在是#p#分頁標題#e#細胞來源,血清質量和水源(自己配制溶液的話)。我看到版上許多人養細胞遇到各種各樣的問題,很多時候bottleneck沒有找到,雖然通過其它方法有所改善,但仍然是事倍功半。因為人們往往注意自己的操作,總覺得自己沒有經驗,而忽視試劑,溶液尤其是細胞的質量,后者其實才是許多細胞培養實驗室常見的問題。
    從**基礎的地方教起,一步一步詳細介紹細胞培養技術,非常好的開門教程
    常用設備
    準備室的設備:單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜(放置未消毒物品)、儲品柜(放置消毒過的物品)、包裝臺。
    配液室的設備:扭力天平和電子天平(稱量藥品)、PH計(測量培養用液PH值)、磁力攪拌器(配置溶液室攪拌溶液)。
    培養室的設備:液氮罐、儲品柜(存放雜物)、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱(-80)、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺(書寫實驗記錄)。
    必須放在無菌間的設備:離心機(收集細胞)、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱(孵育培養物)、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4冰箱(放置serum和培養用液)。
    無菌操作
    無菌室的滅菌:
    定期打掃無菌室:每周打掃一次,先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等,然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過氧乙酸擦拭。
    CO2孵箱(培養箱)滅菌:先用3‰新潔爾滅擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸,再用紫外燈照射
    實驗前滅菌:打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20-30分鐘
    實驗后滅菌:用75%酒精(3‰新潔爾滅)擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
    實驗人員的無菌準備:
    肥皂洗手。
    穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋
    75%酒精棉球擦凈雙手。
    無菌操作的演示:
    凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面
    靠近酒精燈火焰操作。
    器皿使用前必須過火滅菌
    繼續使用的器皿(如瓶蓋、滴管)要放在高處,使用時仍要過火。
    各種操作要靠近酒精燈,動作要輕、準確,不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
    吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管,防止交叉污染。
    器械的清洗和消毒
    玻璃器械洗消:
    一、新的玻璃器皿的洗消:
    自來水刷洗,除去灰塵。
    烘干、泡鹽酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。
    刷洗、烘干:12小時后立即用自來水沖洗,再用洗滌劑刷洗,自來水沖干凈后用烤箱烘干。
    泡酸、清洗:用清潔液(重鉻酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml)浸泡12小時,然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次,**后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。
    烘干、包裝:洗干凈后先烘干,然后用牛皮紙(油光紙)包裝。
    高壓消毒:包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子,打開開關和安全閥,當蒸氣成直線上升時,關閉安全閥,當指針指向15磅時,維持20-30分鐘。
    高壓消毒后烘干
    二、舊的玻璃器皿的洗消
    刷洗、烘干:使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中,泡過來蘇爾溶液(洗滌劑)的器皿要用清水刷洗干凈,然后烘干。
    泡酸、清洗:烘干后泡入清潔液(酸液),12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗(避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗),再用蒸餾水沖洗3次。
    烘干、包裝:洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝,以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
    高壓消毒:包裝好的器皿裝入高壓鍋內,蓋好蓋子,打開開關和安全閥,隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣,當蒸氣成直線冒出#p#分頁標題#e#3-5分鐘后,關閉安全閥,氣壓表指數隨之上升,當指針指向15磅時,調節電開關維持20-30分鐘即可。(玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上)
    烘干備用:因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕,所以要放入烤箱內烘干備用。
    金屬器械洗消:
    金屬器皿不能泡酸,洗消時可先用洗滌劑刷洗,后用自來水沖干凈,然后用75%酒精擦拭,再用自來水,然后用蒸餾水沖洗,再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓(30分鐘)消毒,再烘干備用。
    橡膠和塑料:
    橡膠和制品通常處理方法是:先用洗滌劑洗刷干凈,再分別用自來水和蒸餾水沖干凈,再用烤箱烘干,然后根據不同品質進行如下的處理程序:
    針式濾器帽不能泡酸液,NaOH6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張,安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上),然后將螺旋稍微擰松一些,放入鋁盒中在高壓鍋內1530分鐘消毒,再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。
    膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘(用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒,烘干備用。
    膠帽,離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(切記時間不能過長),自來水洗凈,烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘,再用自來水,蒸餾水,三蒸水洗凈,烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒,烘干備用。
    膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘,然后紫外照射后使用即可。
    塑料培養瓶,培養板,凍存管:
    其他消毒方法:
    有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸氣消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子,放在超凈臺臺面上,直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000radr射線消毒塑料制品效果**好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆,可在紙包裝后,用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水,在包裝紙上作一記號,平時__這種墨水不帶痕跡,一經高溫,即出現字跡,從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制:氯化鉆(CoC12•6H2O)2g,30%鹽酸10m1,蒸餾水88m1。
    注意事項:
    嚴格執行高壓鍋的操作規程:高壓消毒時,先檢查鍋內是否有蒸餾水,以防高壓時燒干,水不能過多因為其將使空氣流暢受阻,會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢,以防高壓時爆炸。
    安裝濾膜時注意光面朝上:注意濾膜光滑一面是正面,要朝上,否則起不到過濾的作用。
    注意人體的防護和器皿的完全浸泡:A.泡酸時要戴耐酸手套,防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面,會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有氣泡,以防止泡酸不徹底。
    細胞培養用液的配制與消毒
    器材與試劑:干粉型培養基、胰蛋白酶,青霉素、鏈霉素. 純凈水系統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。
    具體步驟:
    . 水的制備:
    細胞培養用水必須非常純凈,不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水
    .PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制)
    1.溶解定容:將藥品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2#p#分頁標題#e#HPO4•H2O1.56g,KH2PO40. 2g)倒入盛有雙蒸水的燒杯中,玻璃棒攪動,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中準確定容**1000ml,搖勻即成新配制的PBS溶液。
    2.移入溶液瓶內待消毒:將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內,蓋上膠帽,并插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。
    . 胰蛋白酶溶液的配制與消毒
    胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關,在pH8.0、溫度為37時,胰酶溶液的作用能力**強。使用胰酶時,應把握好濃度、溫度和時間,以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+BSS,如:D-Hanks液。終止消化時,可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
    1.稱取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液濃度為0.25%,用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調PH7.2左右)或PBSD-hanks)液中。攪拌混勻,置于4內過夜。
    2.用注射濾器抽濾消毒:配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20保存以備使用。
    .青、鏈霉素溶液的配制于消毒
    1. 所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。
    2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶,用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶,加5ml滅菌雙蒸水,即每毫升各為20萬單位。
    3.使用時溶入培養液中,使青鏈霉素的濃度**終為100單位/ml。1單位=1微克?
    .RPMI1640的制備與消毒
    1.溶解、調PH值、定容:先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3(沖洗液一并加入培養基中),充分攪拌**粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH7.2左右。**后定容**1000ml,搖勻。
    2.安裝蔡式濾器:安裝時先裝好支架,按規定放好濾膜,用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
    3.抽濾:配制好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。
    4.分裝:將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于4冰箱內待用。
    5.使用前要向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4時兩周有效)。
    六.血清的滅火
    細胞培養常用的是小牛血清,新買來的血清要在56水浴中滅火30分鐘后,再經過抽濾方可加入培養基中使用。#p#分頁標題#e#
    .HEPES溶液
    HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑,能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L,一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。
    1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下:
    準確稱取HEPTS 238.3g,加入新鮮三蒸水定容**1L。過濾除菌,分裝后4保存。
    注意:因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶,所以可根據實際情況靈活配制,但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如:稱取4.766HEPES溶于20ml三蒸水中,過濾除菌后可完全(20ml)加入1L培養液中,或者每100ml培養液中加入2ml即可。
    .谷氨酰胺
    合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質,谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚**死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定,4下放置1周可分解50%,故應單獨配制,置于-20冰箱中保存,用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在4冰箱中儲存2周以上時,應重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L??梢耘渲?/strong>200mmol/L谷氨酰胺液貯存,用時加入培養液。配制方法為,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液,充分攪拌溶解后,過濾除菌,分裝小瓶,-20保存,使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
    .肝素溶液的配制
    含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高,肝素加入全培養液中**終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉,包裝為約為0.56/瓶,配制時,可將其溶于100ml三蒸水中,定容,過夜,然后過濾除菌,分裝小瓶,保存溫度為
    使用時,向100ml培養液中加入1ml(精確可加入0.9ml)即可。
    . 型膠原酶
    0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意:因為型膠原酶分子顆粒比胰酶大,不容易過濾,因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。
    十一.明膠溶液
    因為明膠難于過濾,所以配制0.1%明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。shou要的問題是如何無菌準確稱量0.1克(配成100ml溶液)即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液,明膠也難溶,因此要充分搖勻,過夜放置,然后無菌分裝入50ml小瓶中, 4保存。
    其他培養用液的配制:
    20ug/ml內皮生長因子,
    注意事項:
    1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。
    2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張,放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方,并且要特別注意濾膜光面朝上。
    3.配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,為了保證培養液PH#p#分頁標題#e#值**終為7.2,可在配制時調PH**7.4。
    細胞傳代培養(消化法)
    具體操作:
    . 傳代前準備:
    1.預熱培養用液:把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內預熱。
    2.75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
    3.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。
    4.點燃酒精燈:注意火焰不能太小。
    5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶,放入微波爐內高火,8分鐘再次消毒。
    6.取出預熱好的培養用液:取出已經預熱好的培養用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
    7.從培養箱內取出細胞:注意取出細胞時要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面,再在鏡下觀察細胞。
    8.打開瓶口:將各瓶口一一打開,同時要在酒精燈上燒口消毒。
    .胰蛋白酶消化;
    1.加入消化液:小心吸出舊培養液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細胞**好,**佳消化溫度是37。
    2. 顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度。
    3.吸棄消化液加入培養液:棄去胰蛋白酶液,注意更換吸管,加入新鮮的培養液。
    三、吹打分散細胞:
    1.吹打制懸:用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
    2.吸細胞懸液入離心管:將細胞懸液吸入10ml離心管中。
    3.平衡離心:平衡后將離心管放入臺式離心機中,以1000/分鐘離心6-8分鐘。
    4.棄上清液,加入新培養液:棄去上清液,加入2ml培養液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
    .分裝稀釋細胞:
    1.分裝:將細胞懸液吸出分裝**2-3個培養瓶中,加入適量培養基旋緊瓶蓋。
    2.顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察細胞量,必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長,傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。**后要做好標記。
    .繼續培養:
    用酒精棉球擦拭培養瓶,適當旋松瓶蓋,放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25%時為一個+,占50%為++,占75%時為+++。
    傳代細胞培養注意事項:
    1.嚴格的無菌操作
    2.適度消化:消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應該注意培養細胞形態的變化,一旦胞質回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
    附:EDTA0.02%乙二胺四乙酸二鈉)消化液配方:
    EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚紅4ml,加入蒸餾水定容**1000ml。1020min高壓滅菌,使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培養瓶要徹底清洗,否則再培養時細胞容易脫壁。
    細胞的復蘇
    細胞復蘇的原則-快速融化:必須將凍存在-196液氮中的細胞快速融化**37,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶,對細胞造成損害。#p#分頁標題#e#
    具體操作
    . 實驗前準備:
    1.將水浴鍋預熱**37
    2.75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
    3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。
    二.取出凍存管:
    1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
    2.從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號。
    三.迅速解凍:
    1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動,使管中的液體迅速融化。
    2.1-2min后凍存管內液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。
    .平衡離心:
    用架盤天平平衡后,放入離心機中3000r/min 離心3min
    .制備細胞懸液:
    1.吸棄上清液。
    2.向離心管內加入10ml培養液,吹打制成細胞懸液。
    .細胞計數:
    細胞濃度以5×105/ml為宜。
    .培養細胞
    將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內,將培養瓶放入375CO2的培養箱內2-4小時或者24-48小時)后換液繼續培養培養,換液的時間由細胞情況而定。
    初學者易犯錯誤:
    1水浴鍋未預熱或者未預熱到37。
    2.水浴鍋內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長。
    3.離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
    4.一次復蘇細胞過多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。
    細胞計數
    實驗原理:當待測細胞懸液中細胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細胞的數目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。
    具體操作:
    .準備工作:
    取一瓶傳代的細胞,按照《傳代細胞培養(消化法)》中的傳代方法繁殖細胞,待長成單層后以被使用。
    .細胞懸液制備:
    細胞懸液的制備方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后,加入培養液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液),吹打制成待測細胞懸液。
    .細胞計數:
    1.蓋好蓋玻片:取一套血球計數板,將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。
    2.制備計數用的細胞懸液:用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中,加入5滴臺盼藍染液(0.4%)或苯胺黑,活細胞不會被染色,加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。
    3.將細胞懸液滴入計數板:將待測細胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。
    4.統計四個大格的細胞數:將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數板,當看到鏡中出現計數方格后,數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數目。
    5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度:
    (細胞懸液的細胞數)/ml  四個大格子細胞數/4) ×2×104
    說明:公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。
    公式中乘以2因為細胞懸液于染液是11稀釋。
    公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為:
    1.0mm(長)#p#分頁標題#e#×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3  1ml1000mm3
    .細胞計數要點:
    1.進行細胞計數時,要求懸液中細胞數目不低于104/ml,如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中;
    2.要求細胞懸液中的細胞分散良好,否則影響計數準確性。
    3.取樣計數前,應充分混勻細胞懸液,尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻,以求計數準確;
    4. 數細胞的原則是只數完整的細胞,若細胞聚集成團時,只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時,則只計上線,不計下線,只計右線,不計左線。
    5. 操作時,注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數。
    .初學者易犯的錯誤:
    1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。
    2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。
    3. 滴入懸液時的量太多,**使細胞懸液流入旁邊的槽中。
    .本實驗特殊試劑的配制:
    4%臺盼藍母液:稱取4克臺盼藍,加入少量蒸餾水研磨,加雙蒸水**100毫升,用濾紙過濾,4保存。
    使用液:使用時,用PBS稀釋母液**0.4%即可。
    細胞的凍存
    1.先將凍存管放入4冰箱,約40min。
    2.接著置于-20冰箱,約30-60min。
    3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。
    4.置于液氮罐中長期保存。
    5同時做好凍存記錄,在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。
    注意事項:
    1.使用DMSO前,不需要進行高壓滅菌,它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構,以**于降低冷凍保護效果。在常溫下,DMSO對人體有害,故在配制時**好戴上手套操作。
    2.不宜將凍存細胞放置在0-60這一溫度范圍內過久,低溫損傷主要發生在這一溫度區內,是危險溫區。
    3.注意定期檢查液氮罐內液氮量,及時添加。
    細胞培養三不要
    養細胞是醫學研究生的基本功。我養過骨髓MSC、心肌細胞、心肌成纖維細胞、AD293腺病毒包裝細胞、PA317逆轉錄病毒包裝細胞。養得**多的是MSC。有三個小經驗和大家分享一下:
    1. 不要燒瓶口。大多數人都喜歡在酒精燈的火焰上關瓶子,覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養基怎么越用越發紫的困惑?知道為什么嗎?燒瓶口燒的。培養基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時候,熾熱的空氣進入瓶內。塞緊塞子放入冰箱后,空氣變冷,壓力驟降,培養基中的碳酸就會轉化成二氧化碳,釋放出來。培養基中的碳酸少了,當然會變堿。如果不燒瓶口的話,你會發現培養液變堿的速度會大大減慢。(當然多多少少還是會有一點越用越堿,因為室溫還是比冰箱內的溫度高)
    其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下,你會發現根本就不會燒疼。如果有細菌的話,這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細菌,除非把瓶口和塞子燒紅。我在G內從來就不燒瓶口。來美G以后發現這里更徹底,超凈臺內根本就不點酒精燈。
    2. 不要頻繁看細胞。對于初學者而言,養細胞就像養孩子一樣,有空就要去看看。細胞越是養不好,就越是經常去看。實際上看細胞對細胞的生長沒有任何好處,特別是對原代細胞或是免疫磁珠分選后,密度特別低的細胞。培養基中的生長因子是非常有限的。細胞好不容易自分泌一點兒促生長的因子在其周圍,形成有利于生長的局部環境。你跑去看細胞,培養瓶這么一晃,把因子都給晃散了。經??梢钥吹叫率?*到晚都在看細胞,細胞老是長不好。老手細胞一扔好幾天不管,細胞瘋長。#p#分頁標題#e#
    3. 不要怕消化。在傳代的時候,初學者往往生怕細胞消化過度,早早地終止消化。細胞沒下來就使勁吹燈,吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來,用力吹打對細胞的損傷比消化更大。我師兄在做血管平滑肌原代的時候,37度消化過夜,細胞也沒事。我一般是等細胞完全變圓后才中止消化。細胞輕輕一晃就能下來。還有,動作要輕柔,盡量不要產生氣泡。氣泡在破裂時的機械應力相當大,對細胞的傷害也是很大的。 
    原代培養技術
    一、組織塊直接培養法
    1、取材,用Hank's液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
    2、用手術剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊,再用Hank's液洗三次。
    3、將組織塊轉移**培養瓶,并貼附于瓶底面。
    4、輕輕將培養瓶翻轉,瓶底朝上,向瓶內注入適量的培養液,將培養瓶放置在37恒溫箱內培養。
    5、放置待組織小塊貼附后,將培養瓶慢慢翻轉平放,使組織浸入培養液中(勿使組織漂起),37繼續培養。二、消化培養法
    1、取材,用Hank's液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
    2、用手術剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊,再用Hank's液洗三次。
    3、視組織塊量加入酶液,37中消化20—40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
    4、加入3—5ml培養液以終止酶消化作用(或加入相關酶抑制劑)。
    5、靜置5—10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
    6、1000rpm,離心10分鐘,棄上清液。
    7、加入Hank's液5ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
    8、加入培養液1—2ml(視細胞量),血球計數板計數。
    9、將細胞轉移到培養瓶中,37下培養。
    三、 器官培養
    1、將不銹網做成支架形狀,調整其高度**培養皿的1/2深度平面,在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。
    2、將培養液加入培養皿中,使液面剛剛接觸到濾膜,但不要使其浮起。
    3、將要培養器官組織放在濾膜上,一般厚度不要超過200μm,水平面積不超過10mm2 。
    4、將上述準備好的培養物放入CO2 培養箱,并加注氧氣調整氧分壓,**好到90%。
    5、培養過程中要注意觀察培養液平面,盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
    6、上述可進行器官培養1-3周,每2-3天換液一次,并根據情況做進一步實驗和檢測。
    胚胎干細胞培養:從技巧走向科技
    實驗室培養人類胚胎干細胞是個不小的壯舉,培養的講究,易溶細胞勞動密集型,在一定程度上與其說是精密科學不如說是技巧。
    然而,現在,威斯康星大學麥迪遜分校(the University of Wisconsin-Madison)一研究小組報告,研制了一個完全確定的培養體系,為細胞治療提供更均一更安全產品
    The journal Nature Methods Nov.14上報道,該小組由Laura Kiessling*導,一位威斯康星大學麥迪遜分?;瘜W教授,介紹了一種廉價的、能(適應)所有細胞的(培養)系統,從而免受培養(操作過程中)的不確定性工作(或因素的影響)。
    “這是一項很簡單的技術,任何人都能使用” Kiessling說。
    目前,人類胚胎干細胞培養的大多是用于研究,然而,隨著時間推移培養系統會改進,科學家們仍用鼠源細胞及蛋白的支持干細胞生長的“表面”培養人類細胞,誘導胚胎干細胞。如此會增加病原體,如病毒,如果培養的干細胞用于人體治療,這是一個嚴肅的問題(涉及生物安全)。
    新的培養系統利用一種人工合成的化學方法制成蛋白片段及多肽基質,對干細胞有親和作用。結合界定的培養基,由威斯康星團隊設計的培養系統可以讓細胞處在未分化狀態保持3個月或更長。根據新的報告,該系統也適用于誘導多能干細胞,成人細胞經過遺傳學重編類似于胚胎干細胞。
    Kiessling表示,在該系統,細胞經常被檢測是否分化為所需的細胞類型,在一定時間內與市售有效的細胞培養系統對比看是否達到一致。
    Kiessling表示,**人類胚胎干細胞臨床試驗在進行中,正在啟動人類患者更多試驗,相信在安全性問題上是**高**上的。
    Kiessling解釋,目前通常使用的培養系統是不確定性,并沒有真正知道細胞是否接觸,且無均一性,代與代之間是否存在變異。而我們研發的系統是確定的并且是廉價的。#p#分頁標題#e#
    Kiessling的研究小組的工作得到了美GG立衛生研究院和威斯康星材料科學與工程研究中心大學的支持。
    胞培養中的污染分為兩類,化學污染和生物污染。
    化學污染
    化學污染是一些對細胞有毒性的或對細胞產生刺激的化學物質。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學試劑和質量較差的蒸餾水等。
    化學污染中比較引人注意的是細菌內毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質,對塑料等疏水性強的物質有很強的吸附能力。細菌內毒素可刺激部分細胞產生一些激素或細胞因子,對細胞生長和實驗結果產生影響。細菌內毒素是臨床上的**主要的熱原(即注射到動物體內會導致動物發熱),所以通過細胞培養生產的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產過程中更是要避免細菌內毒素的污染。
    生物污染
    生物污染包括比較容易發現的細菌、霉菌和酵母的污染,和較難發現的病毒、支原體和其他細胞的污染。
    細菌、霉菌和酵母到處存在,它們能在合適的環境中非??焖俚纳L。這些污染比較容易觀察到,它們往往會使其污染的培養液產生可見的變化,或者通過顯微鏡觀察就可以看見。
    由于病毒有種屬特異性,所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發現,因為病毒顆粒特別微小,一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內,對整個細胞培養不是致死的,所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結果。
    1956 年 Robinson 及其同事**發現細胞培養中的支原體污染。90年代初美G的一個調查發現,在該G的細胞培養中,**少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細胞壁,在細胞培養液中幾乎是透明的,同時對常用于細胞培養中的抗生素不敏感,不引起 pH 變化,不使培養液渾濁,所以支原體污染不容易被發現,但是其存在會影響實驗的結果。
    細胞的交叉污染在細胞培養中發生的嚴重程度大大超過人們的想象:1981 年對ATCC細胞株的調查顯示:超過 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。
    細胞培養細節問題
    1. 實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。
    2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。
    3. 小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45° 角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
    4. 工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當等級之無菌操作臺(**少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol 之產生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。
    5. 定期檢測下列項目: 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000 小時/HEPA)。
    6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。
    基礎篇-實驗用品
    1. 種類︰
    1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌,除了玻璃容器與pasteur pipet 外,其它均為塑料無菌制品。
    1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附,培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依實驗需要使用。
    1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
    1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml,均有2 種不同材質,其中polypropylene (PP) 為不透明材質,polystyrene (PS) 為透明材質,可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
    1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉廢棄培養液等。
    1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml#p#分頁標題#e#
    2. 清洗︰
    2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時,洗凈后才開始使用。
    2.2. 用過之玻璃血清瓶,以高壓蒸汽滅菌,洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,勿加清潔劑清洗。
    3. 滅菌︰
    3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋,高壓蒸汽滅菌121, 15 lb, 20 分鐘,置于oven 中烘干。
    3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170, 4 小時。
    3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 , 15 lb, 20 分鐘處理。
    基礎篇-培養基
    1. 液體培養基貯存于4 冰箱,避免光照,實驗進行前放在37 水槽中溫熱。
    2. 液體培養基(加血清) 存放期為六個月,期間glutamine 可能會分解,若細胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
    3. 粉末培養基配制(以1 升為例): 3.1. 細胞培養基通常須添加10 % 血清,因此粉末培養基之配制體積為900 ml,pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差,或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調整pH,而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),因為氯離子對細胞生長可能有影響,且貯存時培養基的pH 易發生改變。
    3.2. 材料: 純水(milli-Q 水或二次**三次蒸餾水,水品質非常重要) ,粉末培養基 ,NaHCO3  ,電磁攪拌器 無菌血清瓶 ,0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 ,pH 計,真空泵,CO2 氣體
    3.3. 步驟:
    3.3.1. 取粉末培養基溶于700 ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
    3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體**飽和,約3-5 分鐘。
    3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合?;旌笕芤褐畃H 應為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調整之。若為太堿,可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時,pH 會升高0.1-0.2。
    3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時分裝**無菌容器中,標示培養基種類、日期、瓶號等,貯存于4。(血清亦可加入培養基中一起過濾)
    3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。
    附-配制培養基之生長測試
    材料: MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
    步驟:
    1. 以待測試培養基培養MDCK cell,接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個well 接種1 × 102 活細胞,同時作對照組實驗。
    2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時即可。
    3. 去除培養基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室溫下靜置10 min。
    4. 去除固定液,水洗二次。
    5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
    6. 去除染液,水洗二次。
    7. 以肉眼計數群落數,并比較之,若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳,則丟棄之。
    基礎篇-抗生素
    1. 細胞庫之細胞培養基不加抗生素 1.1. 培養自ATCC 引進之細胞株,培養基中不加抗生素。 1.2. 培養自其它實驗室引進之細胞株,制作token freeze 前培養基須添加抗生素,待token freeze 通過污染測試后,大量培養時則不加抗生素。
    2. 寄送活細胞時,須將培養液充滿整個flask 時,則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
    3. 若要檢測mycoplasma,則培養基內不可添加gentamicin,因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。
    4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml,注意混合使用后藥物毒性會增強。
    5. 抗生素使用種類與濃度:
    抗生素 工作濃度 儲存溫度 殺滅細菌
    penicillin(青霉素) 100 units/ml -20 G(+) bacteria
    streptomycin(鏈霉素) 100 ug/ml -20  G(+) and G(-) bacteria
    amphotericin B(潮霉素B) 2.5 ug/ml -20 yeast and molds
    fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds
    Chlotetracycline(金霉素) 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria
    gentamicin(慶大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria
    nystatin(制霉菌素) 50 ug/ml -20 yeast and molds
    amphotericin B(潮霉素B) 2.5 ug/ml -20 yeast and molds
    #p#分頁標題#e#基礎篇-血清
    1. 血清必須貯存于–20 ~ -70,若存放于4,請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶,可將40~45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中,由于血清結凍時體積會增加約10 %, 必須預留此膨脹體積之空間,否則易發生污染或容器凍裂之情形。
    2. 一般廠商提供之血清為無菌,不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物,則可將血清加入培養基內一起過濾,勿直接過濾血清。
    3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或–70**4冰箱溶解**,**室溫下全溶后再分裝,一般以50 ml 無菌離心管可分裝40~45 ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,減少沈淀的發生。勿直接由–20直接**37解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。
    4. heat-inactivation 是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須,一般不建議作此熱處理,因為會造成沈淀物之顯著增多,且會影響血清之品質。補體參與之反應有:cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
    5. 勿將血清置于37太久,若在37放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞,而影響血清之品質。
    6. 血清之沈淀物
    6.1. 凝絮物:發生之原因有許多種,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成,這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物,可用離心3000 rpm, 5 min 去除,或離心后上清液可以加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物,因為會阻塞過濾膜。
    6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”:通常經過熱處理之血清,沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”,常會誤認為血清遭受污染,而將血清放在37中欲培養此“微生物“,但在37環境下,又會使此沈淀物增多,更會誤認為微生物之增殖,但以培養細菌之培養基檢測,又沒有污染。一般而言,此小黑點應不會影響細胞之生長,但若懷疑此血清之品質,應立即停用,更換另一批號的血清。
    附-血清之生長測試
    材料: MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
    步驟:
    1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養MDCK 細胞于T75 flask **80% confluency。
    2. 以trypsin-EDTA 處理細胞,離心后,加入適量不加血清之a-MEM 制成細胞懸浮液,并測細胞濃度。以不加血清之a-MEM 稀釋細胞濃度為1×102活細胞數/ ml。
    3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中,并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM,使血清**終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。
    4. 37 oC,5 % CO2 培養箱培養5-7 天,期間不需更換培養基,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸即可。
    5. 去除培養基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室溫下靜置10 min。
    6. 去除固定液,水洗二次。
    7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
    8. 去除染液,水洗二次。
    9. 以肉眼計數群落數
    10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency ): SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
    11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency): SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
    比較各濃度血清培養基之RPE,即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優良血清,置于–70 保存之
    基礎篇-細胞傳代培養
    1. 細胞生長**高密度時,即須分殖**新的培養瓶中,一般稀釋比例為1:3 **1:6,依細胞種類而異。
    2. 材料:
    2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中,保存于–20,使用前放在37#p#分頁標題#e# 水槽回溫。
    2.3. 新鮮培養基
    2.4. 無菌吸管/離心管/培養瓶
    3. 步驟:
    3.1. 附著型胞(adherent cell)
    3.1.1. 吸掉舊培養液。
    3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一**二次。
    3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 作用數分鐘,于倒立顯微鏡下觀察,當細胞將要分離而呈現圓粒狀時,吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA,則在trypsin-EDTA 作用后,加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin 作用,離心后再吸掉上清液。)
    3.1.4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落,加入適量之新鮮培養基,以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊,混和均勻后,依稀釋比例轉移**新的培養瓶中,以正常培養條件培養。
    3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)
    3.2.1. 吸出細胞培養液,放入離心管中,離心1000 rpm 5 分鐘。
    3.2.2. 吸掉上清液,加入適量之新鮮培養基,混和均勻后,依稀釋比例轉移**新的培養瓶中,以正常培養條件培養。
    3.3. 融合瘤(hybridoma)
    3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養三天以上才會產生抗體,若是更換培養基,則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基,直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大,可傾斜放置,或分殖**新培養瓶中。
    基礎篇-細胞冷凍保存 (一)
    1. 注意事項:
    1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態,約為80 – 90 %致密度。
    1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,例如hybridoma 應在冷凍保存前一**二日測試是否有抗體之產生。
    1.3. 注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小體積分裝,4避光保存,勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。
    1.4. 冷凍保存之細胞濃度:
    1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
    1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml,細胞濃度不要太高,某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。
    1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。
    1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須**少5 x 106cells/ml。
    1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。
    1.6. 冷凍方法:
    1.6.1. 傳統方法: 4 10 分鐘---> -20 30 分鐘---> -80 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。
    1.6.2. 程序降溫:利用等速降溫機以–1 ~ -3/分鐘之速度由室溫降**–120,放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。
    基礎篇-細胞冷凍保存 (二)
    2. 材料:
    2.1. 生長良好之培養細胞
    2.2. 新鮮培養基
    2.3. DMSO (Sigma D-2650)
    2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
    2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
    2.6. 血球計數盤與蓋玻片
    2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)
    3. 步驟:
    3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基,觀察細胞生長情形。
    3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO 加入新鮮培養基中,**后濃度為5-10%,混合均勻,置于室溫下待用。
    3.3. 依細胞繼代培養之操作,收集培養之細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。
    3.4. 離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標示完全之冷凍保存管中,1 ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
    3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 10 分鐘→ -20 30 分鐘→ -80 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
    3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中,再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL
    基礎篇-冷凍細胞活化#p#分頁標題#e#
    1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害,導致細胞之死亡。
    2. 細胞活化后,約需數日,或繼代一**二代,其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。
    3. 材料 37 恒溫水,新鮮培養基,無菌吸管/ 離心管/ 培養瓶,液氮或干冰容器
    4. 步驟:
    4.1 操作人員應戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
    4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。
    4.3 將新鮮培養基置于37 °C 水槽中回溫,回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內。
    4.4 取出冷凍管,立即放入37 °C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化,以70 % ethanol 擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。
    4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液,緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例1:10~1:15),混合均勻,放入CO2 培養箱培養。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。
    4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol),依細胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養基之離心管內,離心1,000 rpm, 5 分鐘,移去上清液,加入新鮮培養基,混合均勻,放入CO2 培養箱培養。
    4.7 若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養后隔日更換培養基。
    基礎篇-收到細胞的處理方式 (一)
    1. 收到細胞株包裹時, 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形, 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養, 或立即冷凍保存(置于–70 °C, 隔夜后, 移到液氮)。
    2. 冷凍細胞解凍程序:
    2.1. 依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、血清種類和其它指定之成份和比例,制備培養基。jue大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類, 若因實驗需要, 必須有所不同時, 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成, 確定細胞適應后, 方進行所需之實驗。
    2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清),對細胞而言差異極大,請務必依據細胞株資料單指定之血清種類培養之。
    2.3. 將培養基置于37 °C 水槽中回溫, 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之, 移入無菌操作臺內。取出冷凍管, 立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿, 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后, 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部, 移入無菌操作臺內。
    2.4. 依據細胞種類和濃度,于無菌操作臺內取10 ml 培養基加**T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液,緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養基, 混合均勻,放入37 °C,5 % CO2 培養箱培養。
    2.5. 對jue大多數細胞而言,1 % 以下之冷凍保護劑DMSO,不會對細胞之貼附或活化有不良影響,不需立刻由解凍細胞中去除, 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞,需立即去除DMSO 者, 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中,離心300 xg (約1000 rpm),5 分鐘,小心移去上清液,加入適量新鮮培養基,將細胞均勻混合后, 轉移**培養瓶中, 再放入37 °C, 5 % CO2 培養箱培養。
    基礎篇-收到細胞的處理方式 (二)
    收到T25 flask 細胞時, 處理方式為︰
    1. 于寄送過程中,為避免起泡造成細胞脫落死亡,T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀,并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象,若有任何問題, 不要打開蓋子,請立即通知細胞實驗室。
    2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C, 5 % CO2 培養箱中,使細胞回溫**37 °C, 并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后,于無菌操作箱內取出flask內之培養基,(取出之培養基可以再使用),僅留約5-10ml 培養基于flask 內,依一般培養方式再將細胞置入培養箱中,或細胞已長滿盤, 則將細胞做傳代培養。
    附-細胞計數與存活測試(一)
    1. 原理:
    1.1. 計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。
    1.2. 血球計數盤一般有二個chambers,每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形,其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格,深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以104,即為每ml 中之細胞數目。
    1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料,如果細胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。 #p#分頁標題#e#
    附-細胞計數與存活測試(二)
    3.4. 若不用血球計數盤,可用Coulter counter 作自動計數,惟無法辨別死細胞或活細胞。
    3.5. 范例: T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液,取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan  blue 混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計數盤,計數四大方格內之細胞數目。 活細胞數/方格:55 ,62, 49, 59 死細胞數/方格:5, 3, 4, 6 細胞總數= 243 平均細胞數/方格= 60.75 稀釋倍數= 2 細胞數/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 細胞數/flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率:225/243﹦92.6 %
    升級篇-細胞培養1
    1 冷凍管應如何解凍? 取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。
    2 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO? 除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, jue大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
    3 可否使用與原先培養條件不同之培養基? 不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基, 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。
    4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類? 不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源, 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
    升級篇-細胞培養2
    5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
    6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響? 一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。
    7 何時須更換培養基? 視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。
    8 培養基中是否須添加抗生素?
    除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。
    9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。
    10 懸浮性細胞應如何繼代處理? 一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液**另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋**適當濃度, 重復前述步驟即可。
    升級篇-細胞培養3
    11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速? 欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。
    12 細胞之接種密度為何?
          依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
    13 細胞冷凍培養基之成份為何? 動物細胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。
    14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何? 冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, **次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
    15 冷凍保存細胞之方法? 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C **–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。#p#分頁標題#e#
    升級篇-細胞培養4
    16 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度? 冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
    17 應如何避免細胞污染?
     細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之**好方法。
    18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理? 加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。
    19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?
    不能。除極有經驗之**外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。
    20 支原體污染會對細胞培養有何影響? 支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。
    21 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理? 直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
    22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔? 定期(**少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
    升級篇-細胞培養5
    23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性? 培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。
    24 各種細胞培養用的dish,flask是否均相同? 不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響, 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
    25 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形? 研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。
    26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因? 研究人員在細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后, 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。
    27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因? 冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊
    升級篇-細胞培養6
    28 如何選用特殊細胞系培養基? 培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,**MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養**好**AIM V(12005)培養基(SFM)。
    29 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎? L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有**終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。
    30 GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定? GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有**小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
    31 什么培養基中可以省去加酚紅? 酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。
    升級篇-細胞培養7
    32 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么? 丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。#p#分頁標題#e#
    33二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么? 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。
    34目錄上說,Hank‘s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別? HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。
    升級篇-細胞培養8
    35  當在無血清培養基中添加抗生素時,降低**少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。
    36  一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
    37  大部分添加物和試劑**多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。
     38  在溶解的一周內使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。
    細胞分離試劑(1)
    大部分連續細胞系,強貼壁細胞系,許多早代細胞
    HBSS或無鈣鎂PBS
    0.25%胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中
    細胞表面蛋白完整性重要的連續細胞系
    HBSS或無鈣鎂PBS
    0.05%胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA
    弱貼壁表皮細胞轉化成纖維細胞(要求細胞表面完整性),原代細胞
    HBSS或無鈣鎂PBS
    EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中
    強貼壁早代細胞系
    HBSS或無鈣鎂PBS
    0.25%胰蛋白酶溶解在1mM EDTA,Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS
    細胞分離試劑(2)
    上皮細胞
    0.5mM -1mM EDTA
    0.5mM -1mM EDTA,Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS
    強貼壁細胞,上皮細胞,一些腫瘤細胞
    0.5mM -1mM EDTA
    0.25%胰蛋白酶1mM EDTA,Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂PBS
    厚培養物,多層富含膠原的密集培養
    1mM EDTA
    0.25%胰蛋白酶,200單位/ml膠原酶,1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中
    培養液pH 值變化太快
    CO2 張力不對。培養瓶蓋擰得太緊。NaHCO3 緩沖系統緩沖力不足。培養液中鹽濃度不正確。細菌、酵母或真菌污染。
    (1)按培養液中NaHCO3 濃度增加或減少培養箱內CO2 濃度,2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對應CO2 濃度為5% 到10%。(2)改用不依賴CO2 培養液。
    松開瓶蓋1/4 圈。
    加HEPES 緩沖液**10 到25mM 終濃度。
    在CO2 培養環境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養液,在大氣培養環境中培養改用Hanks 鹽配制的培養液。
    丟棄培養物或用抗生素除菌。
    培養液出現沉淀,但pH值不變
    用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養基成分沉淀下來。冰凍保存培養液。
    用去離子水反復沖洗玻璃器皿,然后除菌。
    將培養液加熱到37,搖動使其溶解如沉淀仍然存在,丟棄培養液。
    培養液出現沉淀, 同時pH 發生變化
    細菌或真菌污染
    丟棄培養物?;蛴每股爻?。
    培養細胞不貼壁
    胰蛋白酶消化過度。支原體污染。培養液中無貼壁因子。
    縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
    分離培養物,檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染,丟棄培養物。#p#分頁標題#e#
    懸浮細胞成簇
    培養液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放DNA。
    用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞,輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。
    分離培養物,檢測支原體。如發現支原體污染,丟棄培養物。
    用DNase I 處理細胞。
    原代細胞培養物污染
    原代培養組織在進入培養前已污染
    培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織。
    培養細胞死亡
    培養箱內無CO2。培養箱內溫度波動太大。細胞凍存或復蘇過程中損傷。培養液滲透壓不正確。培養液種有毒代謝產物堆積。
    檢測培養箱內CO2
    檢查培養箱內溫度
    取新的保存細胞種
    檢測培養液滲透壓。注意:大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。
    換入新鮮培養液
    培養細胞生長減慢
    由于更換不同培養液或血清。培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養物中有少量細菌或真菌污染。試劑保存不當。
    比較新培養液與原培養液成分,比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。
    增加起始培養細胞濃度。
    讓細胞逐漸適應新培養液。
    換入新鮮配制培養液。
    補加谷氨酰胺或生長因子。
    用無抗生素培養液培養,如發現污染,丟棄培養物?;蛴每股爻?。
    血清需保存在-5 到-20。培養液需在2-8避光保存。含血清完全培養液在2-8保存,并在2 周內用完。
    接種細胞起始濃度太低
    細胞已老化
    支原體污染
    增加接種細胞起始濃度。
    換用新的保種細胞。
    分離培養物,檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染,丟棄培養物。
    血清 (1)
    1. 保存血清**好的方法?
    建議血清應保存在-5**-2O。然而,若存放于4時,請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶,建議您無菌分裝血清**恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。
    2. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?
    建議您將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。
    3. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現,該如何處理?
    血清中沉淀物的出現有許多種原因,但**普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝**無菌離心管內,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞您的過濾膜。
    4. 為什么要熱滅活血清?
    加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞,昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。
    血清(2)
    5. 有必要做熱滅活嗎?
    實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚**通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
    6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?
    GIBICO的胎牛血清 沒有預老化,儲存在2-8時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20儲存胎牛血清,避免反復凍融。
    7. 如何避免沉淀物的產生?
    解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20#p#分頁標題#e#**4**室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20**37),實驗顯示非常容易產生沉淀物。
    解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。
    請勿將血清置于37太久。若在37放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。
    血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。
    若必須做血清的熱滅活,請遵守56,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。
    細胞培養中常見的污染情況總結如下:
    常見的污染如下:
    1、細菌:細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,根據感染細菌的不同,可有不同的外形,培養液一般會渾濁變黃,對細胞生長影響明顯。
    仔細檢查一下器皿的滅菌情況,是否在高壓滅菌時放氣時間足夠,壓力足夠!尤其是和儲存培養液接觸的移液管等物品,連續兩次污染的話有可能造成儲存液污染,一定要注意!下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象!
    可在培養液中加相應的抗生素處理
    2、霉菌:培養液是清亮的,倒置顯微鏡下無雜質,37度孵箱培養2-3天,仍清亮,但出現絮狀雜質,鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物,可看到明顯的菌絲,細胞仍可生長,但時間長之后,細胞的活力狀態變差,用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
    CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細胞暫時轉移,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時,使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2月左右),尤其在多雨的季節。
    其它培養箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。
    預 防霉菌污染,可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗;但細胞一旦污染,很難挽救,制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補,建議 舍棄該污染細胞。,將環境徹底消毒,如果所有細胞都污染,可能是系統污染,檢查一下培養基和器材,如果只是個別污染,可能是操作問題,就要注意操作
    3、支原體:黑色的,好象多為多形,培養液一般培養液一般會渾濁,原體感染,G內血清很多都沒有做支原體陰性檢測,而支原體是牛血清中**常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后,細胞病變不很明顯,只是慢慢死去。
    用泰樂菌素,獸用支原體病的藥,但可用于細胞培養,無任何不良反應。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養液培養6天或連續傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
    4、黑蛟蟲:可以穿透濾膜,也可以通過空氣傳播,低倍下為黑色點狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養液也是不渾的,一般不會太影響,細胞還是可以用的。 常常是細胞生長狀態良好,且觀測到的運動物無明顯增多,且培養液顏色、透明度無明顯變化,可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。對細胞生長狀態不會 有明顯影響,在細胞增殖旺盛之后會自然消失,除更換血清外無須特殊處理。建議如果細胞有可能是此種污染的話,可以增加細胞的種板密度,以提高細胞的生存率。
    5、真菌:一般培養液清亮,不變色,鏡下有絲狀物,有些真菌開始很像死細胞碎片,只是它很多很多的小塊很清楚,象珊瑚狀,不象細胞碎 片分不清,慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢,不象細菌那么容易被發現,但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了,也很難救活了。
    6、原蟲:培養液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多,輕微活動,細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細胞狀態不好,邊緣不清楚,細胞不 透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的,但他們的數量小,細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長,只有當他們到達一定的數量 時就會影響到細胞的生長,**終形成惡性循環。
    污染的可能原因:可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環境問題等等
    關于培養基的無菌狀況,取培養基**培養瓶中(不加細胞),37度試培養一段時間后觀察。如果沒有細菌生長 就是操作的問題。
    也可以在培養基中事先加入雙抗(硫酸鏈霉素和氨芐青霉素)。但雙抗有時會影響細胞的狀態,所以在做轉染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗,以避免影響實驗結果。
    1、孵箱應定期用三氧機消毒 或者 紫外光照射,并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內的水應是三蒸水#p#分頁標題#e#
    2、超凈臺取材器材培養液培養瓶操作等因素
    3、超凈臺的風機不能過大,風機到6-8格。否則也可能能致霉菌污染
    4、無菌室經甲醛熏蒸消毒后,可用同等量的氨水噴灑中和,約幾小時即可進入操作。
    以上均源自上相關貼子,然后加以總結希望對大家有用!!
     
    關于“黑膠蟲”或“黑蛟蟲”或“黑焦蟲”的性質或本質,有誰能提供點資料么?比如生物學分類,生活習性,結構形態,高倍鏡或電鏡圖片。另外,有英文相關文獻么?**少名字有英文的么?有人研究這種“蟲子”或“微生物”或“納米級細菌”么?
     
    我們實驗室這段時間經常污染。在低倍鏡下觀察,是很多黑色的小點,在 高倍鏡下,發現黑色小點在原地輕微的顫動,這是黑膠蟲嗎
     
    我的細胞也懷疑是黑膠蟲污染,但是否經空氣傳播?因為同一培養箱中有的細胞中,高倍鏡下可見小黑點游動,有的就沒有,且黑點會長成黑蟲
     
    關于黑膠蟲:
    根據平時的操作,我覺得“黑膠蟲”有沒有可能是以下操作細節方面的問題導致的呢?
    1、有時候血清瓶或者培養瓶上用標記筆寫的字沒有擦掉就直接泡酸,字跡溶解后沉積在酸缸中浸泡的瓶子里沖洗不凈。
    2、過火的時候不小心碰到酒精燈的燈芯,粉塵飛進培養液內。
    3、有的同學習慣將移液管塞棉花的一端在酒精燈上焚燒一下,灰燼飛進培養液內。
    請教!
     
    看貼后,我懷疑我的雜交瘤被霉菌污染了.
    24孔板中央老是有絮狀物,細胞沒死,但生長不佳.將絮狀物吸出后,第二天又有.并且將細胞裹在里面生長.請問這樣的瘤細胞能不能上腹水.
     
    我 培養基里都加了雙抗,剛開始一瓶腫瘤細胞狀態還好,但過了兩三天培養基里會出現很多一團團的東西飄著,瓶底還是有貼壁的細胞,細胞培養基混濁,開始以為是 細胞長得太多,導致接觸抑制死亡,但是倒掉培養基,用PBS洗干凈,把瓶內貼壁的細胞用胰酶消化分裝后,第二天還是出現這種情況。有時如果傳代的細胞特別 少,每天給他換液,到了第三天左右,細胞數目不多,但也出現了上述的情況(很多碎片和團狀物飄著),不知大家有沒有遇到這種情況,幫忙分析分析。謝謝! (我養的都是腫瘤細胞)
     
    “黑膠蟲”=子虛烏有
     
    污染后,培養液味道變臭了是什么污染。
     
    zhyy_ping :
    培養液味道變臭了應該是厭養菌污染.
     
    我 培養基里都加了雙抗,剛開始一瓶腫瘤細胞狀態還好,但過了兩三天培養基里會出現很多一團團的東西飄著,瓶底還是有貼壁的細胞,細胞培養基混濁,開始以為是 細胞長得太多,導致接觸抑制死亡,但是倒掉培養基,用PBS洗干凈,把瓶內貼壁的細胞用胰酶消化分裝后,第二天還是出現這種情況。有時如果傳代的細胞特別 少,每天給他換液,到了第三天左右,細胞數目不多,但也出現了上述的情況(很多碎片和團狀物飄著),不知大家有沒有遇到這種情況,幫忙分析分析。我也有同 樣問題,
     
    malone2001 wrote:
    我培 養基里都加了雙抗,剛開始一瓶腫瘤細胞狀態還好,但過了兩三天培養基里會出現很多一團團的東西飄著,瓶底還是有貼壁的細胞,細胞培養基混濁,開始以為是細 胞長得太多,導致接觸抑制死亡,但是倒掉培養基,用PBS洗干凈,把瓶內貼壁的細胞用胰酶消化分裝后,第二天還是出現這種情況。有時如果傳代的細胞特別 少,每天給他換液,到了第三天左右,細胞數目不多,但也出現了上述的情況(很多碎片和團狀物飄著),不知大家有沒有遇到這種情況,幫忙分析分析。我也有同 樣問題,
    我現在也出現了類似的情況
    有可能是支原體污染
     
    曾經做單抗鋪巨噬細胞,鋪好發現細胞全是會動的,跑的還挺快??!仔細一看,全是滴蟲。感情這只老鼠感染了滴蟲?。。?!我那個郁悶阿!
     
    我的細胞污染探索
    某 天打開孵箱,看到我的L1210的培養瓶培養液又是黃黃的,覺得很不錯,今天又可以傳代了,可是在鏡下一看,細胞雖然明顯增加了,但并沒有象以前那樣長 滿,而且更讓我心驚的是怎么出現了許多黑色的小點,桿狀,而且好像在動來動去,翻轉,旋轉,在細胞很多的地方小點就少,而在細胞較少的地方小點就多,細胞 的活力也沒有以前好了,**反應細菌污染,請實驗室老師過來看,說不是細菌污染,這個點要比細菌的小黑點大的多,也好象不是霉菌,沒有菌絲,沒有常見的團 壯的生長,肯定不對勁,但到底是什么,說不上來。**后,決定換液、洗滌、離心,換瓶,操作結束后鏡下看黑點幾乎看不到了,有點放下心來。
    隔天后去 看,培養液還和上面的一樣,但鏡下,那種東西又出來了,在細胞少的地方,幾乎呈現出粗砂粒樣,我欲哭無淚,知道可能不行了,郁悶的換液后,回家上網·搜, 一個名詞跳了出來:黑膠蟲。黑色、桿狀、運動、細胞不會很快死亡,這些描述簡直驚人的一致,我確定了,我受到了黑膠蟲的襲擊。但黑膠蟲是什么,由于網上說 法不一,我決定探究一下。#p#分頁標題#e#
     
    這是我的探究過程:shou先,培養液略黃,稍有渾濁,鏡下觀察,細胞還沒有死,但是已經不長了,那種東西已經是鋪天蓋地了,滿眼望去,盡是粗砂粒樣,細胞好像成了一個個汪洋中的小島。
    細 胞涂片,送到化驗室,革蘭氏染色,不久電話回報懷疑--真菌。**反應不可能,親自去了化驗室,看到了片上一個個瓜子樣的小點,染色呈黑色??次疫€有些懷 疑,化驗室的同事又作了滴片,鏡下暗視野40倍可見一個個亮白色芝麻樣的東西在游來游去,再次涂片染色仍和以前一樣,并且可以見到芽孢樣的形狀,他們確定 無疑是真菌,但不是常見的念珠軍、霉菌,具體是什么,也說不上來。由于已經蓋棺定論,計劃的HE染色、支原體沒有進行。
    已經將污染的細胞扔掉了。休整幾天。
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